Microtubule-mediated protein transport mechanisms during spermiogenesis

Abstract

Formation of cilia and flagella is a tightly controlled process organized by intraflagellar transport (IFT), for which two motor proteins, kinesin-2 and dynein, are responsible. The exact functions of IFT and IFT-related proteins in spermiogenesis are poorly understood in mammalian species. To investigate mechanisms of IFT during mouse spermatogenesis, a male germ cell-specific knockout mouse model for kinesin-2 subunit kinesin-like protein 3A (KIF3A) was generated. Depletion of KIF3A caused defects in sperm tail development and the core structure, the axoneme, failed to form. A transient microtubular platform, the manchette, surrounds the sperm head during spermiogenesis. In KIF3A-depleted mice, the manchette appeared constricted and its clearance was delayed, causing abnormal head shape, suggesting that IFT and KIF3A function are also important for manchette function. In addition, we identified the KIF1-binding protein (KBP) and the meiosis-specific nuclear structural protein 1 (MNS1) as a novel interaction candidates for KIF3A.

Sperm flagellar protein 2 (SPEF2) has been shown to localize in elongating spermatids, and its interaction with IFT-related protein IFT20 has been established. To characterize the function of SPEF2 in sperm tail formation, a male germ cell-specific conditional knockout mouse model for SPEF2 was generated (Spef2 cKO). Depletion of SPEF2 caused defects in axoneme formation, and similar defects in the manchette and head shaping were observed in KIF3A-depleted mice. We also identified cytoplasmic dynein 1 and GOLGA3 as novel interaction candidates for SPEF2 in the testis. Inhibition of dynein 1 activity in the manchette blocked the SPEF2 transport, suggesting its role in manchette-related transport. IFT20 and SPEF2 localization in the Golgi complex and the delayed appearance of IFT20 in the manchette in Spef2 cKO suggests that SPEF2 functions as an adaptor in dynein 1-mediated transport in elongating spermatids. This study increases our understanding of the protein transport mechanisms required for the formation of functional spermatozoa.

Mikrotubulusvälitteiset proteiinien kuljetusmekanismit spermiogeneesin aikana

Solunsisäisen kuljetusmekanismin (intraflagellar transport, IFT) oikeanlainen toiminta on edellytys värekarvan ja siittiön hännän muodostumiselle. Kuljetusmekanismissa toimivat moottoriproteiinit, kinesiini-2 ja dyneiini ovat vastuussa proteiinien kuljetuksesta. Kuljetusmekanismin toiminta siittiön hännän muodostuksen aikana on vielä melko tuntematon. Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet selvittämään kuljetusmekanismin toimintaa poistamalla kinesiini-2 proteiinin alayksikön kinesiinin-kaltainen proteiini 3A:n (KIF3A) urosten sukusoluista. KIF3A proteiinin poisto aiheutti ongelmia siittiön hännän muodostuksen aikana. Siittiön hännän ydinrakenne, aksoneema, ei muodostunut sekä siittiön pään ympärille hetkellisesti ilmentyvä mikrotubulusrakenne, mansetti, oli epämuodostunut sekä sen poistuminen viivästynyt. Tunnistimme myös KIF3A:n kanssa toimivia proteiineja kiveksessä kuten KIF1:tä sitovan proteiinin (KBP) sekä meioosi-spesifin tuman rakenne proteiinin 1:n (MNS1).

Siittiön flagella proteiini 2:n (SPEF2) on näytetty ilmentyvän siittiön hännän muodostumisen aikana. Sen toiminta IFT kuljetusmekanismiin liittyvän IFT20 proteiinin kanssa on osoitettu aiemmissa tutkimuksissa. Tässä tutkimuksessa teimme urosten sukusoluspesifisen poistogeenisen hiirimallin SPEF2:lle ymmärtääksemme paremmin sen toimintaa siittiön hännän muodostumisen aikana. SPEF2 proteiinin poisto aiheutti ongelmia aksoneeman muodostuksessa, mansetti oli epämuodostunut sekä poisto viivästynyt, samoin kuten havaitsimme KIF3A poistogeenisellä hiirellä. Tunnistimme GOLGA3:n ja sytoplasmisen dyneiini 1:n SPEF2:n kanssa toimiviksi proteiineiksi. Osoitimme myös että dyneiini 1 moottorin toiminnan häiriö estää SPEF2 proteiinin kuljetuksen mansetissa. SPEF2 ja IFT20 proteiinien sijoittuminen Golgiin sekä IFT20 proteiinin viivästynyt paikantuminen mansettiin SPEF2 poistogeenisellä hiirellä viittaavat SPEF2 proteiinin mahdollisesta roolista toimia linkkinä dyneiini 1 moottorin ja IFT20 proteiinin välillä. Tämä tutkimus auttaa ymmärtämään proteiinien kuljetusmekanismeja siittiön kehityksen aikana