Mechanisms of fimbrial Assembly via non-classical Chaperone-usher pathways And receptor recognition by fimbrial adhesins

Abstract

The attachment of a pathogen to target cells is a critical step in establishing an infection. Most Gram-negative pathogens display specialized adhesive pili, or fimbriae, assembled via the dedicated classical, alternative and archaic chaperone-usher (CU) pathways from protein subunits. CU pathways represent attractive inhibition targets, as the suppression of bacterial adhesion will allow the natural clearance of the pathogen without the development of antibiotic resistance. This thesis explores the mechanism and biological significance of the polyvalent attachment of fimbrial adhesins to host cell receptors and elucidates the assembly mechanism of fimbriae via the archaic CU pathway.

In this study, we focused on several medically important polyadhesins: AAF/I (Escherichia coli O4H104), Myf (Yersinia enterocolitica), and Psa (Y. pestis and Y. pseudotuberculosis). We present the atomic resolution crystal structures of the fiber forming subunits of these organelles and show that they are assembled into linear homo- (Myf and Psa) or heteropolymers (AAF/I) by donor strand complementation. Each protein subunit of these three fimbriae binds to host cell receptors, thereby establishing multipoint attachment. The AggA subunits of AAF/I bind to fibronectin via a unique positively charged surface at inter-subunit interfaces. The co-crystal structures of the subunits of Myf and Psa with galactose and choline, respectively, reveal the receptor binding sites and explain differences in the tissue tropism of pathogenic species of Yersinia. The high avidity of the attachment and the ability of polyadhesins to recognize several receptors represent a significant challenge for drug development and underlines the importance of multivalent inhibitors.

To elucidate the fimbriae biogenesis via the archaic CU pathway, we determined the crystal structures of the CsuC-CsuA/B chaperone-subunit preassembly complex and self-complemented CsuA/B pilin subunit from the Csu fimbriae of Acinetobacter baumannii. We show that the biogenesis of archaic systems is strikingly different from that of the classical CU pathway. The CsuC chaperone utilizes a unique subunit anchoring mechanism involving both domains of the protein. Furthermore, CsuC maintains the CsuA/B subunit in a partially disordered state, which allows for a more flexible mode of donor strand exchange. The accessible core of the chaperone-bound subunit might represent a potential inhibition target for archaic pili assembly in bacterial pathogens.

Taudinaiheuttajien kiinnittyminen kohdesoluihin infektion alkaessa on kriittinen vaihe. Useimmilla gramnegatiivisilla bakteereilla on tarttumiseen erikoistuneita fimbrioita, adhesiineja, jotka muodostuvat proteiinialayksiköistä klassisen, vaihtoehtoisen ja arkaaisen kaitsija-portieeri (chaperon-usher, CU) -eritysjärjestelmän kautta. CU-järjestelmät ovat houkuttelevia inhibition kohteita, koska bakteerien kiinnittymisen ehkäisy mahdollistaa taudinaiheuttajien luonnollisen poistamisen ilman, että kehittyy antibioottiresistenssiä. Tässä väitöskirjassa käsitellään polyadhesiinien kiinnittymismekanismia kohdereseptoreihin ja arkaaisen CU-järjestelmän mukaisia fimbrioiden muodostumisperiaatteita.

Tutkimuksemme kohteena olivat lääketieteellisesti tärkeät polyadhesiinit AAF/I (Escherichia coli O4H104), Myf (Yersinia enterocolitica) ja Psa (Y. pestis ja Y. pseudotuberculosis). Ratkaisimme näiden alayksiköiden kiderakenteet atomin tarkkuudella, ja osoitimme, että alayksiköt ryhmittyvät lineaarisiin homo- (Myf ja PSA) tai heteropolymeereihin (AAF/I) donorisäikeen komplementaatio -periaatteen mukaisesti. Jokainen proteiinialayksikkö pystyy kiinnittymään isäntäsolun reseptoreihin, joten polyadhesiinit varmistavat monipistekiinnityksen. AAF/I:t käyttävät AggA- alayksiköiden välillä sijaitsevia ainutlaatuisia positiivisesti varautuneita pintoja kiinnittyäkseen fibronektiiniin. Myf-fimbrioiden alayksikön kiderakenne galaktoosin ja Psa-fimbrioiden alayksikön kiderakenne koliinin kanssa paljastivat reseptorien sitoutumiskohdat ja selittivät näiden patogeenisten Yersinioiden solutropismin erot. Fimbrioiden voimakas sitoutumiskyky ja kyky tunnistaa useita reseptoreita on merkittävä haaste lääkekehitykselle, ja korostaa multivalenttisten inhibiittorien käytön tärkeyttä.

Arkaaisten CU-fimbrioiden biogeneesiä valottaaksemme olemme ratkaisseet CsuC-CsuA/B-kaitsija-alayksikkö -kompleksin ja itsekomplementoidun CsuA/B-alayksikön kiderakenteet Acinetobacter baumanniin Csu-fimbrioista. Osoitimme, että arkaaisten fimbrioiden biogeneesi eroaa olennaisesti klassisesta CU-eritysjärjestelmästä sekä molekyylirakenteeltaan että toimintamekanismiltaan. CsuC-kaitsijaproteiini käyttää ainutlaatuista alayksikön ankkurointimekanismia, johon proteiinin molemmat domainit osallistuvat. Lisäksi CsuC pitää CsuA/B-alayksikön vain osittain laskostettuna, mikä saattaa mahdollistaa joustavamman donori-säikeen vaihdon. Kaitsijaan sidotun alayksikön suojaton ydin on mahdollinen inhibiitiokohde, mikä saattaa auttaa kehittämään uusia mikrobilääkkeitä, joilla pystytään estämään arkaaisten CU-fimbrioiden muodostamista.