Switchable Lanthanide Luminescence for Detection of Biomolecules

Abstract

Binary probes are oligonucleotide probe pairs that hybridize adjacently to a complementary target nucleic acid. In order to detect this hybridization, the two probes can be modified with, for example, fluorescent molecules, chemically reactive groups or nucleic acid enzymes. The benefit of this kind of binary probe based approach is that the hybridization elicits a detectable signal which is distinguishable from background noise even though unbound probes are not removed by washing before measurement. In addition, the requirement of two simultaneous binding events increases specificity. Similarly to binary oligonucleotide probes, also certain enzymes and fluorescent proteins can be divided into two parts and used in separation-free assays. Split enzyme and fluorescent protein reporters have practical applications among others as tools to investigate protein-protein interactions within living cells.

In this study, a novel label technology, switchable lanthanide luminescence, was introduced and used successfully in model assays for nucleic acid and protein detection. This label technology is based on a luminescent lanthanide chelate divided into two inherently non-luminescent moieties, an ion carrier chelate and a light harvesting antenna ligand. These form a highly luminescent complex when brought into close proximity; i.e., the label moieties switch from a dark state to a luminescent state. This kind of mixed lanthanide complex has the same beneficial photophysical properties as the more typical lanthanide chelates and cryptates - sharp emission peaks, long emission lifetime enabling time-resolved measurement, and large Stokes’ shift, which minimize the background signal. Furthermore, the switchable lanthanide luminescence technique enables a homogeneous assay set-up.

Here, switchable lanthanide luminescence label technology was first applied to sensitive, homogeneous, single-target nucleic acid and protein assays with picomolar detection limits and high signal to background ratios. Thereafter, a homogeneous four-plex nucleic acid array-based assay was developed. Finally, the label technology was shown to be effective in discrimination of single nucleotide mismatched targets from fully matched targets and the luminescent complex formation was analyzed more thoroughly. In conclusion, this study demonstrates that the switchable lanthanide luminescencebased label technology can be used in various homogeneous bioanalytical assays.

Kahta nukleiinihappokoetinta, jotka hybridisoituvat vierekkäin komplementaariseen kohdenukleiinihappoon, kutsutaan kaksoiskoettimiksi. Kohteen tunnistamiseksi kaksoiskoettimet voidaan leimata fluoresoivilla väreillä, kemiallisilla ryhmillä tai entsyymeillä. Kaksoiskoettimien etu verrattuna yhden nukleiinihappokoettimen käyttöön on, että kaksoiskoettimien hybridisaatio kohteeseen aikaansaa mitattavan signaalin muodostumisen, vaikka hybridisoitumattomia koettimia ei erotettaisi pois reaktioseoksesta pesuvaiheella ennen mittausta. Kaksoiskoettimilla on hyvä spesifisyys, sillä mitattava signaali muodostuu vain, kun koettimet hybridisoituvat kohdenukleiinihappoon yhtä aikaa. Myös entsyymejä ja fluoresoivia proteiineja voidaan jakaa kahteen osaan. Niitä voidaan käyttää reporttereina erotusvapaissa määrityksissä. Jaetut entsyymit ja fluoresoivat proteiinireportterit ovat käyttökelpoisia erityisesti soluissa tapahtuvien proteiinien välisten vuorovaikutusten tutkimisessa.

Tässä tutkimuksessa esiteltiin uusi leimateknologia, kytkeytyvä lantanidiluminesenssi, jota käytettiin kaksoiskoettimien kanssa. Tässä leimateknologiassa luminoiva lantanidikelaatti on jaettu kahteen ei-luminoivaan osaan, ioninkantajakelaattiin ja valoa keräävään antenniin, jotka kytkeytyvät luminoivaksi kompleksiksi kun osat tuodaan lähelle toisiaan. Tällä kahdesta osasta muodostuvalla luminoivalla lantanidikompleksilla on samat fotofysikaaliset edut kuin tavallisemmin käytetyillä luminoivilla lantanidikelaateilla ja -kryptaateilla: terävät emissiopiikit, pitkä emission elinikä, joka mahdollistaa aikaerotteisen mittaamisen, sekä suuri Stokesin siirtymä. Nämä ominaisuudet pienentävät määrityksen herkkyyttä rajoittavaa taustasignaalia. Kytkeytyvän lantanidiluminesenssin lisäetu on, että niitä hyödyntäen voidaan toteuttaa erotusvapaita määrityksiä.

Tässä väitöstutkimuksessa uuden leimateknologian käyttökelpoisuus osoitettiin ensin herkissä erotusvapaissa nukleiinihappo- ja proteiinimäärityksissä, joissa saavutettiin pikomolaarinen herkkyys ja korkea signaalin ja taustan suhde. Seuraavaksi kehitettiin erotusvapaa monianalyyttimääritys neljän kohdenukleiinihapon yhtäaikaiseen havaitsemiseen. Lopuksi uuden leimateknologian osoitettiin soveltuvan myös yhden nukleotidin mutaatioiden erotteluun ja luminoivan kompleksin muodostumista tutkittiin tarkemmin. Loppupäätelmänä voidaan todeta, että tämä tutkimus osoitti kytkeytyvän lantanidiluminesenssin mahdollisuudet erilaisissa erotusvapaissa määrityksissä.