From Molecular Blocks To Bioanalytical Assays: Combining Lanthanide Luminescence and Bioaffinity Binders for Protein Detection
Päkkilä, Henna (2014-12-05)
From Molecular Blocks To Bioanalytical Assays: Combining Lanthanide Luminescence and Bioaffinity Binders for Protein Detection
Päkkilä, Henna
(05.12.2014)
Turun yliopisto Annales Universitatis Turkuensis A I 498
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:ISBN:978-951-29-5928-0
https://urn.fi/URN:ISBN:978-951-29-5928-0
Kuvaus
Siirretty Doriasta
Tiivistelmä
Measuring protein biomarkers from sample matrix, such as plasma, is one of the basic tasks in clinical diagnostics. Bioanalytical assays used for the measuring should be able to measure proteins with high sensitivity and specificity. Furthermore, multiplexing capability would also be advantageous. To ensure the utility of the diagnostic test in point-of-care setting, additional requirements such as short turn-around times, ease-ofuse and low costs need to be met. On the other hand, enhancement of assay sensitivity could enable exploiting novel biomarkers, which are present in very low concentrations and which the current immunoassays are unable to measure. Furthermore, highly sensitive assays could enable the use of minimally invasive sampling. In the development of high-sensitivity assays the label technology and affinity binders are in pivotal role. Additionally, innovative assay designs contribute to the obtained sensitivity and other characteristics of the assay as well as its applicability.
The aim of this thesis was to study the impact of assay components on the performance of both homogeneous and heterogeneous assays. Applicability of two different lanthanide-based label technologies, upconverting nanoparticles and switchable lanthanide luminescence, to protein detection was explored. Moreover, the potential of recombinant antibodies and aptamers as alternative affinity binders were evaluated. Additionally, alternative conjugation chemistries for production of the labeled binders were studied. Different assay concepts were also evaluated with respect to their applicability to point-of-care testing, which requires simple yet sensitive methods.
The applicability of upconverting nanoparticles to the simultaneous quantitative measurement of multiple analytes using imaging-based detection was demonstrated. Additionally, the required instrumentation was relatively simple and inexpensive compared to other luminescent lanthanide-based labels requiring time-resolved measurement. The developed homogeneous assays exploiting switchable lanthanide luminescence were rapid and simple to perform and thus applicable even to point-ofcare testing. The sensitivities of the homogeneous assays were in the picomolar range, which are still inadequate for some analytes, such as cardiac troponins, requiring ultralow limits of detection. For most analytes, however, the obtained limits of detection were sufficient. The use of recombinant antibody fragments and aptamers as binders allowed site-specific and controlled covalent conjugation to construct labeled binders reproducibly either by using chemical modification or recombinant technology. Luminescent lanthanide labels were shown to be widely applicable for protein detection in various assay setups and to contribute assay sensitivity. Proteiinien mittaaminen biologisesta näytteestä, kuten plasmasta, on kliinisen diagnostiikan perustehtäviä. Kliinisessä diagnostiikassa käytettävien bioanalyyttisten määritysten tulisi olla herkkiä ja tarkkoja, jotta ne voivat mitata proteiineja näytteestä luotettavasti. Lisäksi olisi hyödyllistä pystyä mittaamaan samasta näytteestä monta analyyttiä yhtäaikaisesti. Vieritestaukseen tarkoitettujen testien tulisi edellä mainittujen ominaisuuksien ohella olla nopeita, helppokäyttöisiä ja edullisia. Toisaalta nykyistä merkittävästi herkempien määritysten kehittäminen mahdollistaisi uusien, hyvin pieninä pitoisuuksina esiintyvien biomerkkiaineiden käytön diagnostiikassa. Erittäin herkät määritykset voisivat myös mahdollistaa helposti saatavilla olevien näytemateriaalien käytön. Määrityksen herkkyyteen ja muihin ominaisuuksiin vaikuttavia tekijöitä ovat käytetty leimateknologia sekä sitojamolekyylit. Lisäksi määrityskonseptin valinnalla voidaan vaikuttaa testin suorituskykyyn ja sen soveltuvuuteen esimerkiksi vieritestausolosuhteisiin.
Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin kahden luminoivan lantanidileimateknologian soveltuvuutta proteiinien mittaamiseen. Yhdessä osatyössä tutkittiin upkonvertoivien eli käänteisviritteisten luminoivien nanopartikkelien käyttökelpoisuutta monianalyyttimäärityksiin ja kolmessa osatyössä kehitettiin nopeita erotusvapaita määrityksiä mallianalyyteille hyödyntäen kytkeytyvää lantanidiluminesenssia. Osatöissä selvitettiin myös rekombinanttisten vasta-ainefragmenttien ja aptameerien soveltuvuutta proteiinipitoisuuksien mittaamiseen. tutkittiin erilaisia konjugointitapoja leiman ja sitojamolekyylin yhdistämiseksi. Lisäksi arvioitiin eri määritystapojen soveltuvuutta vieritestaussovelluksiin.
Väitöskirjatyössä osoitettiin, että käänteisviritteisiä nanopartikkeleita voidaan hyödyntää usean analyytin yhtäaikaiseen mittaamiseen käyttämällä kuvantavaa mittaustapaa. Tällöin voidaan käyttää yksinkertaisempaa laitteistoa, sillä toisin kuin muut luminoivat lantanidileimat, käänteisviritteiset nanopartikkelit eivät edellytä aikaerotteista mittaustapaa. Kehitetyt erotusvapaat kytkeytyvää lantanidiluminesenssia hyödyntävät määritykset olivat nopeita ja yksinkertaisia suorittaa, ja siten soveltuvia jopa vieritesteihin. Erotusvapaiden määritysten havaintorajat olivat pikomolaarisella alueella, mikä ei ole riittävän herkkä kaikille analyyteille kuten esimerkiksi sydänspesifisille troponiineille, joiden mittaamiseen vaaditaan erittäin herkkiä testejä. Vasta-ainefragmenttien ja oligonukleotidipohjaisten aptameerien käyttö mahdollisti paikkaspesifisen ja kontrolloidun leima-sitojamolekyyli-konjugaatin muodostamisen joko kemiallisesti tai rekombinanttiteknologiaa käyttäen. Käänteisviritteisten luminoivien nanopartikkelien ja kytkeytyvien lantanidileimojen osoitettiin soveltuvan proteiinien detektioon monenlaisissa määrityskonsepteissa.
The aim of this thesis was to study the impact of assay components on the performance of both homogeneous and heterogeneous assays. Applicability of two different lanthanide-based label technologies, upconverting nanoparticles and switchable lanthanide luminescence, to protein detection was explored. Moreover, the potential of recombinant antibodies and aptamers as alternative affinity binders were evaluated. Additionally, alternative conjugation chemistries for production of the labeled binders were studied. Different assay concepts were also evaluated with respect to their applicability to point-of-care testing, which requires simple yet sensitive methods.
The applicability of upconverting nanoparticles to the simultaneous quantitative measurement of multiple analytes using imaging-based detection was demonstrated. Additionally, the required instrumentation was relatively simple and inexpensive compared to other luminescent lanthanide-based labels requiring time-resolved measurement. The developed homogeneous assays exploiting switchable lanthanide luminescence were rapid and simple to perform and thus applicable even to point-ofcare testing. The sensitivities of the homogeneous assays were in the picomolar range, which are still inadequate for some analytes, such as cardiac troponins, requiring ultralow limits of detection. For most analytes, however, the obtained limits of detection were sufficient. The use of recombinant antibody fragments and aptamers as binders allowed site-specific and controlled covalent conjugation to construct labeled binders reproducibly either by using chemical modification or recombinant technology. Luminescent lanthanide labels were shown to be widely applicable for protein detection in various assay setups and to contribute assay sensitivity.
Tässä väitöskirjatyössä tutkittiin kahden luminoivan lantanidileimateknologian soveltuvuutta proteiinien mittaamiseen. Yhdessä osatyössä tutkittiin upkonvertoivien eli käänteisviritteisten luminoivien nanopartikkelien käyttökelpoisuutta monianalyyttimäärityksiin ja kolmessa osatyössä kehitettiin nopeita erotusvapaita määrityksiä mallianalyyteille hyödyntäen kytkeytyvää lantanidiluminesenssia. Osatöissä selvitettiin myös rekombinanttisten vasta-ainefragmenttien ja aptameerien soveltuvuutta proteiinipitoisuuksien mittaamiseen. tutkittiin erilaisia konjugointitapoja leiman ja sitojamolekyylin yhdistämiseksi. Lisäksi arvioitiin eri määritystapojen soveltuvuutta vieritestaussovelluksiin.
Väitöskirjatyössä osoitettiin, että käänteisviritteisiä nanopartikkeleita voidaan hyödyntää usean analyytin yhtäaikaiseen mittaamiseen käyttämällä kuvantavaa mittaustapaa. Tällöin voidaan käyttää yksinkertaisempaa laitteistoa, sillä toisin kuin muut luminoivat lantanidileimat, käänteisviritteiset nanopartikkelit eivät edellytä aikaerotteista mittaustapaa. Kehitetyt erotusvapaat kytkeytyvää lantanidiluminesenssia hyödyntävät määritykset olivat nopeita ja yksinkertaisia suorittaa, ja siten soveltuvia jopa vieritesteihin. Erotusvapaiden määritysten havaintorajat olivat pikomolaarisella alueella, mikä ei ole riittävän herkkä kaikille analyyteille kuten esimerkiksi sydänspesifisille troponiineille, joiden mittaamiseen vaaditaan erittäin herkkiä testejä. Vasta-ainefragmenttien ja oligonukleotidipohjaisten aptameerien käyttö mahdollisti paikkaspesifisen ja kontrolloidun leima-sitojamolekyyli-konjugaatin muodostamisen joko kemiallisesti tai rekombinanttiteknologiaa käyttäen. Käänteisviritteisten luminoivien nanopartikkelien ja kytkeytyvien lantanidileimojen osoitettiin soveltuvan proteiinien detektioon monenlaisissa määrityskonsepteissa.
Kokoelmat
- Väitöskirjat [2889]