Extended hydrogen photoproduction by nitrogen-fixing cyanobacteria

Abstract

Cyanobacteria are the only prokaryotic organisms performing oxygenic photosynthesis. They comprise a diverse and versatile group of organisms in aquatic and terrestrial environments. Increasing genomic and proteomic data launches wide possibilities for their employment in various biotechnical applications. For example, cyanobacteria can use solar energy to produce H2. There are three different enzymes that are directly involved in cyanobacterial H2 metabolism: nitrogenase (nif) which produces hydrogen as a byproduct in nitrogen fixation; bidirectional hydrogenase (hox) which functions both in uptake and in production of H2; and uptake hydrogenase (hup) which recycles the H2 produced by nitrogenase back for the utilization of the cell.

Cyanobacterial strains from University of Helsinki Cyanobacteria Collection (UHCC), isolated from the Baltic Sea and Finnish lakes were screened for efficient H2 producers. Screening about 400 strains revealed several promising candidates producing similar amounts of H2 (during light) as the ΔhupL mutant of Anabaena PCC 7120, which is specifically engineered to produce higher amounts of H2 by the interruption of uptake hydrogenase. The optimal environmental conditions for H2 photoproduction were significantly different between various cyanobacterial strains. All suitable strains revealed during screening were N2-fixing, filamentous and heterocystous. The top ten H2 producers were characterized for the presence and activity of the enzymes involved in H2 metabolism. They all possess the genes encoding the conventional nitrogenase (nifHDK1). However, the high H2 photoproduction rates of these strains were shown not to be directly associated with the maximum capacities of highly active nitrogenase or bidirectional hydrogenase. Most of the good producers possessed a highly active uptake hydrogenase, which has been considered as an obstacle for efficient H2 production. Among the newly revealed best H2 producing strains, Calothrix 336/3 was chosen for further, detailed characterization. Comparative analysis of the structure of the nif and hup operons encoding the nitrogenase and uptake hydrogenase enzymes respectively showed minor differences between Calothrix 336/3 and other N2-fixing model cyanobacteria.

Calothrix 336/3 is a filamentous, N2-fixing cyanobacterium with ellipsoidal, terminal heterocysts. A common feature of Calothrix 336/3 is that the cells readily adhere to substrates. To make use of this feature, and to additionally improve H2 photoproduction capacity of the Calothrix 336/3 strain, an immobilization technique was applied. The effects of immobilization within thin alginate films were evaluated by examining the photoproduction of H2 of immobilized Calothrix 336/3 in comparison to model strains, the Anabaena PCC 7120 and its ΔhupL mutant. In order to achieve optimal H2 photoproduction, cells were kept under nitrogen starved conditions (Ar atmosphere) to ensure the selective function of nitrogenase in reducing protons to H2. For extended H2 photoproduction, cells require CO2 for maintenance of photosynthetic activity and recovery cycles to fix N2. Application of regular H2 production and recovery cycles, Ar or air atmospheres respectively, resulted in prolongation of H2 photoproduction in both Calothrix 336/3 and the ΔhupL mutant of Anabaena PCC 7120. However, recovery cycles, consisting of air supplemented with CO2, induced a strong C/N unbalance in the ΔhupL mutant leading to a decrease in photosynthetic activity, although total H2 yield was still higher compared to the wild-type strain. My findings provide information about the diversity of cyanobacterial H2 capacities and mechanisms and provide knowledge of the possibilities of further enhancing cyanobacterial H2 production.

Syanobakteerit ovat ainoita prokaryoottisia eliöitä, jotka kykenevät fotosynteesiin. Syanobakteerit ovat monimuotoisia ja niitä löytyy lähes jokaisesta elinympäristöstä. Lisääntyvä tieto eri lajien genomeista ja niiden ilmentymisestä avaa laajoja mahdollisuuksia syanobakteerien biotekniseen soveltamiseen. Syanobakteerit pystyvät muun muassa valoenergiaa hyväksikäyttäen tuottamaan vetyä. Niillä on kolme entsyymiä, jotka ovat suoraan yhteydessä vetymetaboliaan: nitrogenaasi (nif) tuottaa vetyä typen sitomisen sivutuotteena; kaksisuuntainen hydrogenaasi (hox) sekä kuluttaa että tuottaa vetyä; ja lisäksi vetyä kuluttava hydrogenaasi (hup) kierrättää nitrogenaasin tuottaman vedyn takaisin solun energiakäyttöön.

Tässä tutkimuksessa seulottiin Itämerestä ja Suomen järvistä eristettyjen syanobakteerien (Helsingin yliopiston kantakokoelma, UHCC) joukosta hyvin vetyä tuottavia kantoja. Neljän sadan seulontaan valitun kannan joukosta löytyi muutama villityypin syanobakteerikanta, joiden vedyn tuotanto on samalla tasolla kuin geenitekniikan avulla muokattujen kantojen tehostettu vedyntuottokyky – kuten Anabaena 7120 -kannan hup poistogeeninen mutantti (ΔhupL). Ihanteelliset olosuhteet vedyn valotuotannolle vaihtelevat eri kantojen välillä. Kaikki seulonnassa valikoituneet kannat ovat ilmakehän typpeä sitovia, rihmamaisia ja heterokystejä muodostavia. Vedyn tuotantoon osallistuvat kartoitettiin kymmeneltä parhaalta kannalta, joilta kaikilta löydettiin tavallista nitrogenaasia (nifHDK1) koodaavat geenit. Valittujen kantojen korkea vedyn tuotantokyky ei kuitenkaan osoittautunut olevan suoraa seurausta nitrogenaasin tai kaksisuuntaisen hydrogenaasin korkeasta aktiivisuudesta. Suurimmalla osalla parhaista vedyntuottajista osoittautui olevan hyvin aktiivinen vetyä kuluttava hydrogenaasi, jonka on ajateltu olevan este tehokkaalle vedyn tuotannolle. Kymmenen parhaan vedyntuottajakannan joukosta valittiin Calothrix 336/3 tarkempaan tarkasteluun. Nitrogenaasin ja vetyä kuluttavan hydrogenaasin nif ja hup operonien vertaileva analyysi paljasti pieniä poikkeamia Calothrix 336/3:n ja muiden typpeä sitovien mallikantojen välillä.

Calothrix 336/3 on rihmamainen, typpeä sitova syanobakteeri, jolla on soikion muotoiset, rihmojen päissä olevat heterokystit. Calothrix 336/3:lla on kyky tarttua kiinni erilaisiin pintoihin ja kasvaa niiden pinnalla. Tätä ominaisuutta ja immobilisointi-tekniikkaa hyödyntämällä pystyttiin edelleen parantamaan vedyn valotuotantokapasiteettia. Alginaatilla immobilisointia vedyn valotuotantosysteeminä tutkittiin Calothrix 336/3:lla ja verrattiin sitä Anabaena 7120:een ja sen ΔhupL-mutanttiin samassa systeemissä. Ihanteellisen vedyn valotuotannon saavuttamiseksi, soluja pidettiin typpivapaissa olosuhteissa (Ar kaasufaasina), näin varmistaen nitrogenaasin toiminnan protonien pelkistämisessä vedyksi. Lisäksi syanobakteerisolut tarvitsevat pitkäaikaiseen vedyn valotuotantoon myös hiilidioksidia fotosynteettisen aktiivisuuden säilyttämiseksi sekä palautumissyklit mahdollistaakseen typen sitomisen. Säännöllisten vedyn valotuotantojaksojen ja palautumissyklien avulla, joissa Ar tai ilma toimivat kaasufaaseina, saatiin sekä Calothrix 336/3:n ja Anabaena 7120 ΔhupL-mutantin vedyn valotuotantoa huomattavasti pitkitettyä. On huomionarvoista, että ilman ja lisätyn hiilidioksidin toimiessa palautumissyklissä, ΔhupL-mutantin fotosynteettinen aktiivisuus väheni C/N epätasapainon johdosta, vaikka sen vedyn tuotto olikin parempi kuin vastaavan villityypin. Tutkimukseni lisää tietoa syanobakteerien vedyntuotannon moninaisuudesta ja mekanismeista, sekä lisää ymmärrystä syanobakteerien vedyn tuotannon lisäämiseksi tulevaisuudessa.