Oxygen Photoreduction in Cyanobacteria

Abstract

Cyanobacteria are well-known for their role in the global production of O2 via photosynthetic water oxidation. However, with the use of light energy, cyanobacteria can also reduce O2. In my thesis work, I have investigated the impact of O2 photoreduction on protection of the photosynthetic apparatus as well as the N2-fixing machinery. Photosynthetic light reactions produce intermediate radicals and reduced electron carriers, which can easily react with O2 to generate various reactive oxygen species. To avoid prolonged reduction of photosynthetic components, cyanobacteria use “electron valves” that dissipate excess electrons from the photosynthetic electron transfer chain in a harmless way. In Synechocystis sp. PCC 6803, flavodiiron proteins Flv1 and Flv3 comprise a powerful electron sink redirecting electrons from the acceptor side of Photosystem I to O2 and reducing it directly to water. In this work, I demonstrate that upon Ci-depletion Flv1/3 can dissipate up to 60% of the electrons delivered from Photosystem II. O2 photoreduction by Flv1/3 was shown to be vital for cyanobacteria in natural aquatic environments and deletion of Flv1/3 was lethal for both Synechocystis sp. PCC 6803 and Anabaena sp. PCC 7120 under fluctuating light conditions. The lethal phenotype observed in the absence of Flv1/3 results from oxidative damage to Photosystem I, which appeared to be a primary target of reactive oxygen species produced upon sudden increases in light intensity. Importantly, cyanobacteria also possess other O2 photoreduction pathways which can protect the photosynthetic apparatus. This study demonstrates that respiratory terminal oxidases are also capable of initiating O2 photoreduction in mutant cells lacking the Flv1/3 proteins and grown under fluctuating light. Photoreduction of O2 by Rubisco was also shown in Ci-depleted cells of the mutants lacking Flv1/3, and thus provided the first evidence for active photorespiratory gas-exchange in cyanobacteria. Nevertheless, and despite the existence of other O2 photoreduction pathways, the Flv1/3 route appears to be the most robust and rapid system of photoprotection.

Several groups of cyanobacteria are capable of N2 fixation. Filamentous heterocystous N2- fixing species, such as Anabaena sp. PCC 7120, are able to differentiate specialised cells called heterocysts for this purpose. In contrast to vegetative cells which perform oxygenic photosynthesis, heterocysts maintain a microoxic environment for the proper function of the nitrogenase enzyme, which is extremely sensitive to O2. The genome of Anabaena sp. PCC 7120 harbors two copies of genes encoding Flv1 and Flv3 proteins, designated as “A” and “B” forms. In this thesis work, I demonstrate that Flv1A and Flv3A are expressed only in the vegetative cells of filaments, whilst Flv1B and Flv3B are localized exclusively in heterocysts. I further revealed that the Flv3B protein is most responsible for the photoreduction of O2 in heterocysts, and that this reaction plays an important role in protection of the N2-fixing machinery and thus, the provision of filaments with fixed nitrogen. The function of the Flv1B protein remains to be elucidated; however the involvement of this protein in electron transfer reactions is feasible. Evidence provided in this thesis indicates the presence of a great diversity of O2 photoreduction reactions in cyanobacterial cells. These reactions appear to be crucial for the photoprotection of both photosynthesis and N2 fixation processes in an oxygenic environment.

Syanobakteerien tiedetään osallistuvan maailmanlaajuiseen hapentuotantoon fotosynteesissä tapahtuvan veden hajotuksen, eli kemiallisesti veden hapetuksen, kautta. Valoenergian avulla syanobakteerit myös pelkistävät ilmakehän happea, jolloin lopputuotteena syntyy vettä. Väitöskirjatyössäni olen tutkinut hapen valopelkistyksen molekyylimekanismeja ja roolia syanobakteerien fotosynteesi- ja typensidontakoneistojen suojelemisessa. Fotosynteesin valoreaktioissa syntyy välituotteina monenlaisia radikaaleja ja pelkistyneitä elektroninsiirtäjiä, jotka reagoivat herkästi hapen kanssa synnyttäen erilaisia reaktiivisia happilajeja. Välttääkseen fotosynteesikoneiston pitkittynyttä pelkistymistilaa, syanobakteerit käyttävät ”elektroniventtiilejä”, joiden kautta ne purkavat fotosynteesikoneistoon kertyneet ylimääräiset elektronit vaarattomasti. Synechocystis sp. PCC 6803:n flavodiironproteiinit Flv1 ja Flv3 muodostavat tehokkaan elektroninielun ohjaamalla elektroneja valoreaktio I:n pelkistävältä puolelta suoraan hapelle pelkistäen sen vedeksi. Tässä työssä osoitan, että kun syanobakteereja kasvatetaan matalassa hiilidioksidipitoisuudessa (tasapainossa ympäröivän ilman kanssa), Flv1/3 proteiinipari pystyy kuluttamaan jopa 60% valoreaktio II:n veden hajotuksesta johdetuista elektroneista. Flv1/3-välitteisen hapen valopelkistyksen näytettiin olevan elintärkeää syanobakteereille luonnollisessa vesiympäristössä ja Flv1/3 proteiinien poistaminen johti sekä Synechocystis sp. PCC 6803:n että Anabaena sp. PCC 7120:n kuolemaan vaihtelevan valon olosuhteissa. Flv1/3:n puuttumisen aiheuttaman letaalin ilmiasun osoitettiin johtuvan valoreaktio I:n foto-oksidatiivisesta vaurioitumisesta: äkillinen valointensiteetin nousu johtaa reaktiivisten happilajien muodostumiseen, ja valoreaktio I näytti olevan näiden happilajien pääasiallinen kohde. Flv1/3:n lisäksi syanobakteereilla on myös muita hapen valopelkistämisreittejä, jotka voivat toimia fotosynteesikoneiston suojaamisessa. Tämä tutkimus osoittaa, että hengitysreitin terminaaliset oksidaasit kykenevät myös hapen valopelkistykseen vaihtelevan valon olosuhteissa mutanttisoluissa, joilta puuttuvat Flv1 ja 3 proteiinit. Matalassa hiilidioksidissa näissä mutanttisoluissa voitiin mitata myös Rubisco-välitteistä hapen valopelkistymistä, osoittautuen ensimmäiseksi raportiksi syanobakteerien aktiivisesta fotorespiratorisesta kaasujen vaihdosta. Huolimatta muista hapen valopelkistysreiteistä, Flv1/3 välitteinen reitti näyttäisi olevan kuitenkin vahvin ja nopein fotosynteesikoneiston suojausmekanismi.

Monet syanobakteeriryhmät kykenevät ilmakehän typen sidontaan. Rihmamaiset typpeä sitovat syanobakteerit, kuten Anabaena sp. PCC 7120, kykenevät muodostamaan typen sidontaan erilaistuneita soluja: heterokystejä. Toisin kuin yhteyttävissä vegetatiivisissa soluissa, heterokysteissä ylläpidetään lähes hapetonta ympäristöä, joka vaaditaan happiherkän nitrogenaasientsyymin toimintaan. Anabaena sp. PCC 7120:n genomissa on Flv1 että Flv3 proteiineja koodaavista geeneistä kaksi kopiota, niin kutsutut ”A” ja ”B” muodot. Väitöskirjatyössäni osoitan, että Flv1A ja Flv3A ilmentyvät vain syanobakteeririhmojen vegetatiivisissa soluissa, kun taas Flv1B ja Flv3B sijaitsevat ainoastaan heterokysteissä. Lisäksi näytän, että Flv3B on pääasiassa vastuussa hapen valopelkistyksestä heterokysteissä ja että tämä reaktio on tärkeä typpeä sitovan koneiston suojaamisessa ja siten takaa rihmojen typen saannin. Flv1B proteiinin tarkka rooli on vielä selvittämättä, mutta on mahdollista, että se osallistuu elektroninsiirtoreaktioihin. Tässä väitöskirjassa esitetty todistusaineisto viittaa siihen, että syanobakteereilla on useita hapen valopelkistysreittejä. Nämä reaktiot ja reitit ovat välttämättömiä sekä fotosynteettisen että typpeä sitovan koneiston suojelemiseksi hapelta, jota fotosynteesi jatkuvasti tuottaa veden hajotusreaktioissaan.