Advanced biofuel production: Engineering metabolic pathways for butanol and propane biosynthesis.

Abstract

Greenhouse gases emitted from energy production and transportation are dramatically changing the climate of Planet Earth. As a consequence, global warming is affecting the living conditions of numerous plant and animal species, including ours. Thus the development of sustainable and renewable liquid fuels is an essential global challenge in order to combat the climate change.

In the past decades many technologies have been developed as alternatives to currently used petroleum fuels, such as bioethanol and biodiesel. However, even with gradually increasing production, the market penetration of these first generation biofuels is still relatively small compared to fossil fuels. Researchers have long ago realized that there is a need for advanced biofuels with improved physical and chemical properties compared to bioethanol and with biomass raw materials not competing with food production. Several target molecules have been identified as potential fuel candidates, such as alkanes, fatty acids, long carbon‐chain alcohols and isoprenoids.

The current study focuses on the biosynthesis of butanol and propane as possible biofuels. The scope of this research was to investigate novel heterologous metabolic pathways and to identify bottlenecks for alcohol and alkane generation using Escherichia coli as a model host microorganism. The first theme of the work studied the pathways generating butyraldehyde, the common denominator for butanol and propane biosynthesis. Two ways of generating butyraldehyde were described, one via the bacterial fatty acid elongation machinery and the other via partial overexpression of the acetone‐butanol‐ethanol fermentation pathway found in Clostridium acetobutylicum. The second theme of the experimental work studied the reduction of butyraldehyde to butanol catalysed by various bacterial aldehyde‐reductase enzymes, whereas the final part of the work investigated the in vivo kinetics of the cyanobacterial aldehyde deformylating oxygenase (ADO) for the generation of hydrocarbons.

The results showed that the novel butanol pathway, based on fatty acid biosynthesis consisting of an acyl‐ACP thioesterase and a carboxylic acid reductase, is tolerant to oxygen, thus being an efficient alternative to the previous Clostridial pathways. It was also shown that butanol can be produced from acetyl‐CoA using acetoacetyl CoA synthase (NphT7) or acetyl‐CoA acetyltransferase (AtoB) enzymes. The study also demonstrated, for the first time, that bacterial biosynthesis of propane is possible. The efficiency of the system is clearly limited by the poor kinetic properties of the ADO enzyme, and for proper function in vivo, the catalytic machinery requires a coupled electron relay system.

Energiatuotannon ja liikenteen aiheuttamat kasvihuonekaasupäästöt muuttavat jatkuvasti maapallon ilmastoa, mikä vaikuttaa kaikkiin maapallolla eläviin lajeihin, myös ihmisiin. Uusiutuvien, ympäristöystävällisten polttoaineiden kehittäminen onkin yksi keskeisimmistä haasteista taistelussa ilmaston lämpenemistä vastaan.

Viimeisten vuosikymmenten aikana on kehitetty useita teknologioita uusiutuvien polttoaineiden valmistamiseksi fossiilisten polttoaineiden rinnalle. Esimerkiksi bioetanolin ja biodieselin osuus käytetyistä polttoaineista on ollut jatkuvassa kasvussa, joskin niiden markkinaosuus on edelleen vain murto‐osa verrattuna uusiutumattomiin polttoaineisiin. Tutkijat ovat yhtä mieltä siitä, että muutokseen vaaditaan uusia vaihtoehtoisia biopolttoaineita, joiden fysikaaliset ja kemialliset ominaisuudet ovat nykyisiä paremmat ja joiden valmistamiseen käytettävä biomassa ei kilpaile ruuantuotannon kanssa. Mahdollisia uusiutuvista lähteistä saatavia polttoaineita ovat esimerkiksi alkaanit, rasvahapot, pitkäketjuiset alkoholit ja isoprenoidit.

Väitöskirjatyö keskittyy kahden polttoaineen, butanolin ja propaanin, valmistamiseen mikrobien avulla. Tavoitteena oli rakentaa keinotekoisia biosynteesireittejä polttoaineiden tuottamiseksi Escherichia coli –bakteerissa, sekä tutkia systeemien toimintaa ja niiden keskeisiä rajoittavia tekijöitä. Työn ensimmäinen vaihe keskittyi biosynteesireiteille yhteisen välituotteen, butyraldehydin, tuottamiseen. Kahdessa rinnakkain suunnitellussa systeemissä butyraldehydiä valmistettiin joko bakteerin omaa rasvahappobiosynteesikoneistoa apuna käyttäen, tai Clostridium acetobutylicum –bakteerin asetoni‐butanoli‐etanoli –käymistiestä muokatun biosynteesireitin kautta. Työn toisessa osa‐alueessa tutkittiin butyraldehydin muuntamista butanoliksi solun sisällä aldehydi reduktaasi –ensyymien avulla. Kolmas osio käsitteli vaihtoehtoisen lopputuotteen, propaanin, biosynteesiä ja viimeistä reaktiota katalysoivan ADO‐entsyymin (aldehydia deformyloiva oxygenaasi) toimintaa.

Työ osoitti, että rasvahappoaineenvaihdunnan välituotteisiin perustuva keinotekoinen butanolin tuottosysteemi ei ole herkkä hapelle ja tarjoaa näin ollen vaihtoehdon anaerobisille Clostridium –biosynteesireiteille. Lisäksi tulokset osoittivat, että butanolia voidaan tuottaa E. coli –bakteerissa myös asetyyli‐CoA –lähtöaineesta, käyttäen hyväksi asetoasyyli CoA syntaasi ‐ (NphT7) ja asetyyli CoA asetyylitrasferaasi (AtoB) –entsyymeitä. Työn keskeisimmät tulokset liittyivät propaanin biosynteesiin: Tutkimus todisti ensimmäistä kertaa, että propaanin tuottaminen bakteerisoluissa on mahdollista. Keskeisiä tuottotehoa rajoittavia tekijöitä olivat ADO‐entsyymin kineettiset ominaisuudet, sekä entsyymin toiminnalle välttämättömän pelkistyssysteemin toiminta.