Interactions between Human Mesenchymal Stem Cells and Circulating Mononuclear Cells in Bone Regeneration

Abstract

Despite the regenerative actions of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) and optimal reduction, ossification is delayed in almost 10% of all fractures, requiring surgical intervention. The gold standard for treating non-unions and delayed unions is a tissue auto- or allograft, which, nevertheless, can cause several specific problems, such as donor site morbidity, disease transmission and immunological rejection. To overcome these problems, tissue-engineered bone grafts are being developed. They are sensitive to hypoxia, however, and can quickly undergo apoptosis in the host tissue. Therefore, improved methods for inducing proper angiogenesis and tissue endothelialisation are vital. It is known that peripheral blood mononuclear cells (PB-MNCs) include endothelial progenitor cells (EPCs), which are responsible for neoangiogenesis in adult tissues, and these cells have been suggested as a potential source of bone graft vascularization. The aims of this study were to utilize the interactions between human BM-MSCs and PB-MNCs: Firstly, to develop a method of endothelialising an MSC-culture; secondly, to optimize the differentiation capacity of MSCs into bone-forming osteoblasts; and, thirdly, to characterize the cellular and molecular factors essential in these processes. The results showed that a co-culture of human MSCs and MNCs led to a powerful endothelial cell differentiation and tubular structure formation, even without any exogenous growth factors. Furthermore, the osteoblastic differentiation and bone formation in the co-culture setting was more efficient than in monocultures and was further potentiated when cultures were supplemented with exogenous VEGF. Finally, it was shown that both endothelial and pericyte differentiation were induced in MSC-MNC co-cultures and that the expression profile of various proangiogenic factors was dependent on culture conditions. In conclusion, this study demonstrates that the key events that stimulate successful bone healing can be induced in co-cultures of human MSCs and MNCs. This co-culture method can be used to enhance osteoblast, endothelial cell and pericyte differentiation and could therefore have potential in the further development of tissue-engineered bone grafts.

Ihmisen mesenkymaalisten kantasolujen ja verenkierron mononukleaaristen solujen vuorovaikutukset luunmurtuman paranemisessa

Luuytimen mesenkymaaliset kantasolut erilaistuvat luuta muodostaviksi osteoblasteiksi eri signaalien ohjaamina. Ne toimivat kantasolureservinä, mutta myös tärkeinä tekijöinä kudosten uusiutumisessa, kuten murtuman paranemisessa. Solujen toiminnasta ja murtuman optimaalisesta reduktiosta huolimatta n. 10 %:ssa murtumia luutuminen viivästyy, jolloin tarvitaan luusiirrettä. Tähän liittyy kuitenkin erityisiä ongelmia, kuten luovuttajakudoksen vaurioita ja immunologisia hyljintäreaktioita, minkä vuoksi onkin pyritty kehittämään kudosteknologisesti valmistettuja siirteitä. Nämä ovat kuitenkin herkkiä hapenpuutteelle, minkä vuoksi tarvitaan soluviljelymenetelmiä, joilla voitaisiin tehostaa verisuonten uudismuodostusta kudossiirteessä.

Verenkierron mononukleaaristen solujen joukossa on verisuonten uudismuodostukseen osallistuvia endoteelisolujen esiasteita. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena olikin edellä mainittujen solujen vuorovaikutuksia hyödyntämällä tehostaa mesenkymaalisten kantasolujen erilaistumiskykyä luuta muodostaviksi soluiksi ja saada aikaan hapensaannin kannalta keskeinen soluviljelmän endotelisaatio. Lisäksi tavoitteena oli karakterisoida näissä prosesseissa keskeisiä molekulaarisia signaalitekijöitä.

Tässä työssä osoitettiin, että ihmisen mesenkymaaliset kantasolut saivat aikaan mononukleaaristen solujen erilaistumisen juostemaisia rakenteita muodostaviksi endoteelisoluiksi ilman lisättyjä kasvutekijöitä. Työssä todettiin myös, että mesenkymaalisten kantasolujen ja mononukleaaristen solujen yhteisviljelmissä luun muodostus on tehokkaampaa kuin yksittäisviljelmissä. Lisäksi osoitettiin, että luunmuodostus tehostui edelleen, kun yhteisviljelmään lisättiin verisuonen endoteelisolukasvutekijää (VEGF). Yhteisviljelmässä tapahtui myös sekä endoteelisolujen että perisyyttien erilaistumista. Molekulaarisia mekanismeja ja eri signaalitekijöitä tutkittiin tarkemmin Transwell-kalvomenetelmää sekä kvantitatiivista RT-PCR:ää käyttäen ja todettiin, että proangiogeeniset tekijät ilmentyvät eri tavoin eri viljelyolosuhteissa. Tässä työssä kehitetyssä soluviljelymallissa pystyttiin siis saamaan aikaan monet murtuman paranemisen kannalta keskeiset solutapahtumat, ja se avaakin uusia näkökulmia tulevaisuuden kudosteknologisesti valmistettujen luusiirteiden kehitystyölle.