Elektrokemiluminesenssi- ja ELISA-menetelmien kehitys IFN beta-1a:n ja biomerkkiaineiden mittaamiseksi kliinisen tutkimuksen näytteistä
Latvala, Santeri (2018-05-28)
Elektrokemiluminesenssi- ja ELISA-menetelmien kehitys IFN beta-1a:n ja biomerkkiaineiden mittaamiseksi kliinisen tutkimuksen näytteistä
Latvala, Santeri
(28.05.2018)
Tätä artikkelia/julkaisua ei ole tallennettu UTUPubiin. Julkaisun tiedoissa voi kuitenkin olla linkki toisaalle tallennettuun artikkeliin / julkaisuun.
Turun yliopisto
Tiivistelmä
Interferonit ovat laajasti käytettyjä lääkeaineita. Interferoni beta (IFN β) on glykoproteiini, jonka molekyylipaino on noin 22 500 daltonia. IFN β vaikuttaa sitoutumalla reseptoreihin solupinnalla, mikä saa aikaan monimutkaisia solunsisäisiä vaikutuksia ja aiheuttaa biomarkkereiden vapautumista verenkiertoon. Työn tavoitteena oli kehittää kaupallisiin kitteihin perustuvat menetelmät neopteriinin, beta-2-mikroglobuliinin (B2M), myxovirus resistenssiproteiini 1:n (MxA), interleukiini-4:n (IL-4), interleukiini-10:n (IL-10) ja IFN β-1a:n kvantitatiiviseen mittaamiseen.
Neopteriini, B2M ja MxA menetelmät perustuivat 96-mikrotiitterilevyllä tehtävään entsyymivälitteiseen immunosorbenttimääritykseen (ELISA), jossa peroksidaasientsyymin katalysoimana tetrametyylibentsidiinisubstraatti (TMB) saa aikaan värimuutoksen. Entsyymireaktio pysäytettiin happamalla liuoksella ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 450 nm. IL-4:n ja IL-10:n mittaamiseen käytettävät menetelmät perustuivat elektrokemiluminesenssiin, missä 96-kuoppalevyn pohjalla olevaan elektrodiin johdettiin sähkövirta. Sähkövirrasta johtuen sitojavasta-aineen ja analyytin muodostamaan kompleksiin sitoutunut leimattu detektiovasta-aine emittoi valoa, jonka intensiteetti mitattiin. IFN β-1a:n mittaamiseen oli kaksi kittivaihtoehtoa. Toinen vaihtoehto perustui elektrokemiluminesenssiin ja toinen ELISAan.
Menetelmien kehityksessä testattiin näytteiden endogeeninen taso, menetelmän toistettavuus, selektiivisyys ja laimennosten lineaarisuus. Korkean pitoisuuden neopteriini ja B2M näytteet laimenivat lineaarisesti, mutta MxA näyte ei. IL-4 ja IL-10 menetelmä oli monianalyyttimääritys, missä kontrollien tarkkuus toistomittauksissa oli hyväksyttävällä tasolla, vaikka IL-4 ei ollut yhtä toistettava kuin IL-10. On mahdollista, että jokin menetelmän sisäinen tekijä vaikutti enemmän IL-4:ään kuin IL-10:een. Korkea näyte laimeni lineaarisesti hyväksyttävissä rajoissa, vaikka IL-4:lla oli havaittavissa nousua takaisin lasketussa konsentraatiossa.
IFN β-1a:n menetelmäksi valikoitui ELISAan perustuva määritys, jonka herkkyys oli riittävällä tasolla verrattuna elektrokemiluminesenssiin pohjautuvaan määritykseen. Kaikki menetelmät pystytettiin onnistuneesti tarkoituksiin sopiviksi. Menetelmät validoidaan vielä ennen varsinaisia kliinisiä näyteanalyysejä FDA:n ja EMA:n sääntöjen mukaisesti.
Neopteriini, B2M ja MxA menetelmät perustuivat 96-mikrotiitterilevyllä tehtävään entsyymivälitteiseen immunosorbenttimääritykseen (ELISA), jossa peroksidaasientsyymin katalysoimana tetrametyylibentsidiinisubstraatti (TMB) saa aikaan värimuutoksen. Entsyymireaktio pysäytettiin happamalla liuoksella ja absorbanssi mitattiin aallonpituudella 450 nm. IL-4:n ja IL-10:n mittaamiseen käytettävät menetelmät perustuivat elektrokemiluminesenssiin, missä 96-kuoppalevyn pohjalla olevaan elektrodiin johdettiin sähkövirta. Sähkövirrasta johtuen sitojavasta-aineen ja analyytin muodostamaan kompleksiin sitoutunut leimattu detektiovasta-aine emittoi valoa, jonka intensiteetti mitattiin. IFN β-1a:n mittaamiseen oli kaksi kittivaihtoehtoa. Toinen vaihtoehto perustui elektrokemiluminesenssiin ja toinen ELISAan.
Menetelmien kehityksessä testattiin näytteiden endogeeninen taso, menetelmän toistettavuus, selektiivisyys ja laimennosten lineaarisuus. Korkean pitoisuuden neopteriini ja B2M näytteet laimenivat lineaarisesti, mutta MxA näyte ei. IL-4 ja IL-10 menetelmä oli monianalyyttimääritys, missä kontrollien tarkkuus toistomittauksissa oli hyväksyttävällä tasolla, vaikka IL-4 ei ollut yhtä toistettava kuin IL-10. On mahdollista, että jokin menetelmän sisäinen tekijä vaikutti enemmän IL-4:ään kuin IL-10:een. Korkea näyte laimeni lineaarisesti hyväksyttävissä rajoissa, vaikka IL-4:lla oli havaittavissa nousua takaisin lasketussa konsentraatiossa.
IFN β-1a:n menetelmäksi valikoitui ELISAan perustuva määritys, jonka herkkyys oli riittävällä tasolla verrattuna elektrokemiluminesenssiin pohjautuvaan määritykseen. Kaikki menetelmät pystytettiin onnistuneesti tarkoituksiin sopiviksi. Menetelmät validoidaan vielä ennen varsinaisia kliinisiä näyteanalyysejä FDA:n ja EMA:n sääntöjen mukaisesti.