Homogeeninen monianalyyttimääritys XLA- ja SCID-oireyhtymille
Pihlava, Julia (2018-06-06)
Homogeeninen monianalyyttimääritys XLA- ja SCID-oireyhtymille
Pihlava, Julia
(06.06.2018)
Tätä artikkelia/julkaisua ei ole tallennettu UTUPubiin. Julkaisun tiedoissa voi kuitenkin olla linkki toisaalle tallennettuun artikkeliin / julkaisuun.
Turun yliopisto
Tiivistelmä
Primaari immuunipuutostauti on harvinainen perinnöllinen häiriö immuunipuutoksessa. Primaarisiin immuunipuutostauteihin kuuluu noin 300 sairautta, joiden vakavuus vaihtelee lievästä kuolemaan johtavaan. Primaarien immuunipuutostautien luokittelun perusteella sairaudet, joissa ei kehity toimivia T-soluja luokitellaan kombinoituihin immuunipuutostauteihin. Kombinoidun immuunipuutostaudin vakavin muoto on SCID-oireyhtymä (engl. severe combined immunodeficiency). SCID-oireyhtymää sairastava vastasyntynyt menehtyy ensimmäisen vuoden aikana, jos potilas ei saa hoitoa. Primaareihin immuunipuutostauteihin kuuluvassa XLA-oireyhtymässä (engl. X-linked agammaglobulinemia, XLA) virhe B-solujen tuottamisessa johtaa toiminnallisten B-solujen ja immunoglobuliinien puutokseen. XLA-oireyhtymässä esiintyy monenlaisia oireita, ja se voi hoitamattomana olla myös kuolemaan johtava.
T-solujen erilaistumisen aikana T-solun antigeenireseptorin geeniä koodaavaa DNA:ta muokataan satunaisessa geneettisessä rekombinaatiossa, jonka seurauksena muodostuu sirkulaarista TREC-DNA:ta. TREC-DNA:n määrän veressä on todettu korreloivan toimivien T-solujen määrän kanssa, ja siten sen avulla voidaan tunnistaa SCID-oireyhtymää sairastava potilas. T-solun tavoin B-solun kypsymisen aikana, satunnaisen geneettisen rekombinaation seurauksena, muodostuu sirkulaarista KREC-DNA:ta (engl. kappa-deleting recombination excision circles, KREC). Matala KREC-pitoisuus potilaan veressä on osoitus XLA-oireyhtymästä.
PerkinElmerillä on aikaisemmin kehitetty EnLite™ Neonatal TREC PCR-määritys SCID-oireyhtymän seulontaan, jossa tunnistetaan samasta PCR-reaktiokuopasta TREC-DNA:ta ja PCR-monistuskontrollina toimivaa beta-aktiini-DNA:ta. Diplomityön tarkoituksena oli kehittää XLA-oireyhtymää tunnistava PCR-määritys ja lisätä XLA-oireyhtymän tunnistaminen SCID-oireyhtymää havaitsevaan EnLite™ Neonatal PCR-määritykseen.
Diplomityössä leimattiin kahta eripituista KREC-koetinta neljällä eri vastaanottajaleimalla. Parhaiten monianalyyttimääritykseen soveltui 13 nukleotidin pituinen KREC-oligonukleotidikoetin Alexa Fluor 700 -vastaanottajaleimalla leimattuna. Diplomityössä valittiin kolmesta eri KREC-alukeparivaihtoehdosta 5’- ja 3´-alukepari, jolla havaittiin vähiten epäspesifistä sitoutumista PCR-monianalyyttimäärityksessä. Työn aikana optimoitiin KREC-alukkeiden pitoisuutta. Työn viimeisessä vaiheessa määrityskonseptilla analysoitiin onnistuneesti 82 vastasyntyneen veritäplänäytettä. Diplomityössä kehitettiin monianalyyttimäärityskonsepti SCID- ja XLA-oireyhtymän seulontaan ja saavutettiin työn päätavoite.
T-solujen erilaistumisen aikana T-solun antigeenireseptorin geeniä koodaavaa DNA:ta muokataan satunaisessa geneettisessä rekombinaatiossa, jonka seurauksena muodostuu sirkulaarista TREC-DNA:ta. TREC-DNA:n määrän veressä on todettu korreloivan toimivien T-solujen määrän kanssa, ja siten sen avulla voidaan tunnistaa SCID-oireyhtymää sairastava potilas. T-solun tavoin B-solun kypsymisen aikana, satunnaisen geneettisen rekombinaation seurauksena, muodostuu sirkulaarista KREC-DNA:ta (engl. kappa-deleting recombination excision circles, KREC). Matala KREC-pitoisuus potilaan veressä on osoitus XLA-oireyhtymästä.
PerkinElmerillä on aikaisemmin kehitetty EnLite™ Neonatal TREC PCR-määritys SCID-oireyhtymän seulontaan, jossa tunnistetaan samasta PCR-reaktiokuopasta TREC-DNA:ta ja PCR-monistuskontrollina toimivaa beta-aktiini-DNA:ta. Diplomityön tarkoituksena oli kehittää XLA-oireyhtymää tunnistava PCR-määritys ja lisätä XLA-oireyhtymän tunnistaminen SCID-oireyhtymää havaitsevaan EnLite™ Neonatal PCR-määritykseen.
Diplomityössä leimattiin kahta eripituista KREC-koetinta neljällä eri vastaanottajaleimalla. Parhaiten monianalyyttimääritykseen soveltui 13 nukleotidin pituinen KREC-oligonukleotidikoetin Alexa Fluor 700 -vastaanottajaleimalla leimattuna. Diplomityössä valittiin kolmesta eri KREC-alukeparivaihtoehdosta 5’- ja 3´-alukepari, jolla havaittiin vähiten epäspesifistä sitoutumista PCR-monianalyyttimäärityksessä. Työn aikana optimoitiin KREC-alukkeiden pitoisuutta. Työn viimeisessä vaiheessa määrityskonseptilla analysoitiin onnistuneesti 82 vastasyntyneen veritäplänäytettä. Diplomityössä kehitettiin monianalyyttimäärityskonsepti SCID- ja XLA-oireyhtymän seulontaan ja saavutettiin työn päätavoite.