Photosynthetic cyanobacteria as future biotechnological hosts; considerations in regards to metabolite toxicity and cofactor redox balance

Abstract

There is an increasing global need for developing new sustainable alternatives and technological solutions for replacing oil‐based products currently in use. In response to this demand, photosynthetic cyanobacteria have been extensively studied as nextgeneration biotechnological hosts for the large‐scale production of different carbonbased chemicals of interest directly from CO2. The strategy is based on the intrinsic capacity of cyanobacterial cells to utilize solar energy for fixing CO2 into complex organic molecules, together with our ability to engineer the cells for increased product range and improved performance. This Thesis is an expansion to the long‐term basic research carried out at the Molecular Plant Biology (Department of Biochemistry, University of Turku, Finland), which aims to understand the molecular mechanisms of photosynthesis and associated regulatory networks. The key focus of the Thesis is on i) the toxicity of a range of end‐products and related biosynthetic intermediates, and ii) enzymatic factors associated with the native regulation of intracellular cofactor redox homeostasis in cyanobacteria.

The first part of the Thesis concentrated on evaluating the growth‐inhibitory effects of several chemicals and metabolites associated with hydrocarbon biosynthesis, towards a range of cyanobacterial species. The objective was to gain information which could be used for rational selection of the most appropriate target chemicals, engineering strategies and suitable hosts for biotechnological production trials and further photosynthetic cell factory. The comparison revealed significant differences between the apparent toxicity effects that decreased in the series from aldehydes to alcohols to alkanes, while ethanol and propane appeared as the most prominent candidates for continuous production. The length of the carbon chain was shown to have a clear impact in regards to the physiological tolerance, which expectedly reflected the solubility and capacity to penetrate through the cell membrane. The work also underlined the strain‐specific features between different cyanobacteria, and complications in direct quantitative comparison between alternative hosts.

The second part of the Thesis concentrated on elucidating the biological role of the enzyme pyridine nucleotide transhydrogenase PntAB as part of the regulation of NAD(H)/NADP(H) homeostasis in cyanobacteria. Generation and characterization of Synechocystis sp. PCC 6803 deletion mutant ΔpntA devoid of the native transhydrogenase activity revealed that the enzyme plays a central role in the maintenance of sufficient NADPH supply under mixotrophic growth conditions when the photosynthetic activity of the cell is limited. The activity of PntAB was also linked with ATP metabolism and the photosynthetic repair mechanisms, which together are important considerations for the design of any engineered cyanobacterial systems.

Ihmiskunta on vähitellen siirtymässä fossiilisten raaka‐aineiden aikakaudesta kestävän kehityksen talouteen, ja tämän onnistuminen vaatii systeemisen tason muutoksia nykyisiin tuotantostrategioihin. Osana tätä kehitystä, syanobakteereita on tutkittu mahdollisina tuotto‐organismeina tulevaisuuden bioteknologisiin sovelluksiin. Idea perustuu siihen, että syanobakteerit kykenevät luonnostaan sitomaan auringon energian avulla ilman hiilidioksidia suoraan erilaisiksi orgaanisiksi yhdisteiksi, mikä yhdistettynä yhä kehittyviin geneettisiin muokkausmenetelmiin, avaisi mahdollisuuden moninaisten uusiutuvien kemikaalien teolliseen valmistukseen. Tämä väitöskirjatyö pohjaa Turun yliopiston molekulaarisen kasvibiologian yksikössä tehtyyn uraauurtavaan perustutkimukseen, jonka tavoitteena on ymmärtää fotosynteesiin liittyviä molekyylitason vuorovaikutuksia ja säätelymekanismeja. Väitöskirjan keskeisinä teemoina ovat i) erilaisten kemikaalien syanobakteerisolulle aiheuttamat toksisuusvaikutukset, sekä ii) solunsisäiseen kofaktorien hapetus‐ pelkistystasapainoon ja yhteyttämiseen liittyvät entsymaattiset reaktiot.

Väitöskirjan ensimmäinen osa käsittelee hiilivetyjen biosynteesiin liittyvien erilaisten yhdisteiden haittavaikutuksia syanobakteerisoluille. Tavoitteena oli saada kattavampi käsitys eri yhdisteryhmien välisistä eduista ja rajoitteista, sekä käytössä olevien syanobakteerikantojen ominaisuuksista, jotka tulisi huomioida mahdollisen tuottosysteemin suunnittelussa. Vertailu osoitti, että kemikaalien vaikutus solujen kasvuun väheni siirryttäessä aldehydeistä, alkoholeihin ja siitä edelleen hiilivetyihin, samalla kun hiiliketjun pituus ja kantakohtaiset ominaisuuden vaikuttivat merkittävästi lopputulokseen. Tulokset korostivat myös eri syanobakteerikantojen luontaisia fenotyyppisiä eroja, jotka vaikeuttavat eri kantojen suoraa kvantitatiivista vertailua.

Väitöskirjatyön toisen osakokonaisuuden tavoitteena oli selventää transhydrogenaasi PntAB ‐entsyymin roolia syanobakteerien solunsisäisen NAD(H)/NADP(H) – tasapainotilan säätelyssä. Tulokset osoittivat että PntAB:llä on keskeinen merkitys riittävän NADPH –tason ylläpitämisessä silloin kun valoa ei ole tarpeeksi optimaaliseen autotrofiseen kasvuun ja solu käyttää pääasiallisena energialähteenään glukoosia. Näissä olosuhteissa PntAB‐aktiivisuus voidaan yhdistää epäsuorasti myös solunsisäiseen ATP:n määrään ja sitä kautta fotosysteemi II:n toiminnalle välttämättömien korjausmekanismien toimintaan. Tulokset korostavat NAD(P) ‐ kofaktorien hapetustasapainon merkitystä solun toiminnalle, joka tulee ottaa huomioon uusia biosynteesiteitä suunniteltaessa.