Recognition of double-helical DNA and RNA by modified triplex-forming oligonucleotides and peptide nucleic acids
Tähtinen, Ville (2019-10-11)
Recognition of double-helical DNA and RNA by modified triplex-forming oligonucleotides and peptide nucleic acids
(11.10.2019)
Turun yliopisto
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:ISBN:978-951-29-7786-4
https://urn.fi/URN:ISBN:978-951-29-7786-4
Tiivistelmä
Triplex-forming oligonucleotides (TFOs) have received considerable interest because of their ability to recognize double-helical DNA and RNA sequenceselectively. Sequence-selective binding to double-helical DNA would enable controlling the function of a certain gene through triplex formation, which makes TFOs potential therapeutic agents. In recent years, the recognition of double-helical RNA through triplex formation has attracted increasing interest because of the central role of noncoding, double-helical RNA in cellular processes and gene expression. With TFO-based recognition, it would be possible to detect these double-helical RNA molecules and interfere with their function. However, unmodified TFOs have certain limitations such as poor triplex stability at physiological pH and poor cellular delivery. To overcome these limitations, various chemical modifications have been introduced into TFOs.
In the present thesis, TFOs and triplex-forming peptide nucleic acids (TFPNAs) were modified to increase their affinity for DNA and RNA duplexes. The binding affinity for DNA duplexes could be increased by conjugating TFOs with neomycin, a known groove binder. Moreover, the importance of the conjugation site was demonstrated. The binding affinity and specificity of TFPNAs for RNA duplexes could be increased by introducing chiral backbone modifications. TFPNAs with an appropriate pattern of γ-(R)-hydroxymethyl and γ- (S)-guanidinylmethyl modifications preferred stoichiometric Hoogsteen-face binding to a microRNA-215 model, and the γ-(S)-guanidinylmethyl modifications also enhanced the cellular uptake of TFPNAs. Additionally, 19F-labeled RNA target hairpins and 19F NMR spectroscopy were used to reveal detailed information on the stoichiometry and transition between alternative binding modes, stoichiometric PNA/RNA triplex and ternary (PNA)2/RNA triplex invasion complex. Furthermore, this thesis describes 19F-labeled TFO probes able to recognize variable nucleobases in the pyrimidine strand of double-helical DNA. Kaksoiskierteisen DNA:n ja RNA:n tunnistaminen muokattujen kolmoisjuosteen muodostavien oligonukleotidien ja peptidinukleiinihappojen avulla
Kolmoisjuosteen muodostavat oligonukleotidit (TFOt) ovat herättäneet suurta mielenkiintoa, sillä ne pystyvät sitoutumaan kaksijuosteiseen DNA:han ja RNA:han sekvenssiselektiivisesti. Tämän ominaisuutensa ansiosta TFO-juosteilla on sovelluskohteita esimerkiksi uudenlaisina diagnostisina koettimina ja ne ovat myös potentiaalisia lääkeaineita. Sekvenssiselektiivinen sitoutuminen kaksijuosteiseen DNA:han voisi mahdollistaa haluttujen geenien toiminnan säätelemisen. Myös kaksijuosteisella, ei-koodaavalla RNA:lla on merkittävä rooli geenien ilmenemisessä. TFO-juosteiden avulla näitä kaksijuosteisia RNAmolekyylejä voitaisiin havaita ja niiden toimintaan voitaisiin vaikuttaa. TFOjuosteiden käyttökelpoisuutta rajoittavat kuitenkin esimerkiksi kolmoisjuosteen heikko pysyvyys fysiologisessa pH:ssa ja heikko kulkeutuminen soluun.
Tässä väitöskirjatyössä TFO-juosteita ja kolmoisjuosteen muodostavia peptidinukleiinihappoja (TFPNAt) muokattiin kemiallisesti, jotta niiden sitoutumisvoimakkuus DNA- ja RNA-kaksoisjuosteisiin kasvaisi. Sitoutumisvoimakkuutta DNA-kaksoisjuosteisiin saatiin kasvatettua liittämällä TFO-juosteisiin neomysiiniä, joka pystyy sitoutumaan kolmoisjuosteen isoon uurteeseen. TFPNAjuosteiden sitoutumisvoimakkuutta ja -spesifisyyttä taas saatiin kasvatettua kiraalisilla TFPNA-rakenteilla. TFPNAt, joiden sopiviin kohtiin oli liitetty γ-(R)-hydroksimetyyli- tai γ-(S)-guanidinyylimetyyliryhmiä, suosivat stoikiometristä, Hoogsteen-vetysidoksiin perustuvaa sitoutumista mikroRNA-215-malliin. γ-(S)-guanidinyylimetyyliryhmät myös paransivat TFPNA-juosteiden kulkeutumista soluun. Lisäksi 19F-leimattujen RNA-kaksoisjuosteiden ja 19F-NMRspektroskopian avulla paljastui yksityiskohtaista tietoa TFPNA-juosteiden vaihtoehtoisista sitoutumismekanismeista. Lisäksi tässä väitöskirjatyössä kehitettiin 19F-leimattuja TFO-koettimia, joiden avulla pystyttiin tunnistamaan yksittäisiä nukleoemäksiä DNA-kaksoisjuosteen pyrimidiinijuosteessa.
In the present thesis, TFOs and triplex-forming peptide nucleic acids (TFPNAs) were modified to increase their affinity for DNA and RNA duplexes. The binding affinity for DNA duplexes could be increased by conjugating TFOs with neomycin, a known groove binder. Moreover, the importance of the conjugation site was demonstrated. The binding affinity and specificity of TFPNAs for RNA duplexes could be increased by introducing chiral backbone modifications. TFPNAs with an appropriate pattern of γ-(R)-hydroxymethyl and γ- (S)-guanidinylmethyl modifications preferred stoichiometric Hoogsteen-face binding to a microRNA-215 model, and the γ-(S)-guanidinylmethyl modifications also enhanced the cellular uptake of TFPNAs. Additionally, 19F-labeled RNA target hairpins and 19F NMR spectroscopy were used to reveal detailed information on the stoichiometry and transition between alternative binding modes, stoichiometric PNA/RNA triplex and ternary (PNA)2/RNA triplex invasion complex. Furthermore, this thesis describes 19F-labeled TFO probes able to recognize variable nucleobases in the pyrimidine strand of double-helical DNA.
Kolmoisjuosteen muodostavat oligonukleotidit (TFOt) ovat herättäneet suurta mielenkiintoa, sillä ne pystyvät sitoutumaan kaksijuosteiseen DNA:han ja RNA:han sekvenssiselektiivisesti. Tämän ominaisuutensa ansiosta TFO-juosteilla on sovelluskohteita esimerkiksi uudenlaisina diagnostisina koettimina ja ne ovat myös potentiaalisia lääkeaineita. Sekvenssiselektiivinen sitoutuminen kaksijuosteiseen DNA:han voisi mahdollistaa haluttujen geenien toiminnan säätelemisen. Myös kaksijuosteisella, ei-koodaavalla RNA:lla on merkittävä rooli geenien ilmenemisessä. TFO-juosteiden avulla näitä kaksijuosteisia RNAmolekyylejä voitaisiin havaita ja niiden toimintaan voitaisiin vaikuttaa. TFOjuosteiden käyttökelpoisuutta rajoittavat kuitenkin esimerkiksi kolmoisjuosteen heikko pysyvyys fysiologisessa pH:ssa ja heikko kulkeutuminen soluun.
Tässä väitöskirjatyössä TFO-juosteita ja kolmoisjuosteen muodostavia peptidinukleiinihappoja (TFPNAt) muokattiin kemiallisesti, jotta niiden sitoutumisvoimakkuus DNA- ja RNA-kaksoisjuosteisiin kasvaisi. Sitoutumisvoimakkuutta DNA-kaksoisjuosteisiin saatiin kasvatettua liittämällä TFO-juosteisiin neomysiiniä, joka pystyy sitoutumaan kolmoisjuosteen isoon uurteeseen. TFPNAjuosteiden sitoutumisvoimakkuutta ja -spesifisyyttä taas saatiin kasvatettua kiraalisilla TFPNA-rakenteilla. TFPNAt, joiden sopiviin kohtiin oli liitetty γ-(R)-hydroksimetyyli- tai γ-(S)-guanidinyylimetyyliryhmiä, suosivat stoikiometristä, Hoogsteen-vetysidoksiin perustuvaa sitoutumista mikroRNA-215-malliin. γ-(S)-guanidinyylimetyyliryhmät myös paransivat TFPNA-juosteiden kulkeutumista soluun. Lisäksi 19F-leimattujen RNA-kaksoisjuosteiden ja 19F-NMRspektroskopian avulla paljastui yksityiskohtaista tietoa TFPNA-juosteiden vaihtoehtoisista sitoutumismekanismeista. Lisäksi tässä väitöskirjatyössä kehitettiin 19F-leimattuja TFO-koettimia, joiden avulla pystyttiin tunnistamaan yksittäisiä nukleoemäksiä DNA-kaksoisjuosteen pyrimidiinijuosteessa.
Kokoelmat
- Väitöskirjat [2824]