Dorsaalisen raphe-tumakkeen GABAergisten hermosolujen Cre-rekombinaasivälitteinen geneettinen solulinjakartoitus hiiren sikiössä
Makkonen, Aino (2019-08-28)
Dorsaalisen raphe-tumakkeen GABAergisten hermosolujen Cre-rekombinaasivälitteinen geneettinen solulinjakartoitus hiiren sikiössä
(28.08.2019)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
avoin
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2019093030558
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2019093030558
Tiivistelmä
Dorsaalinen raphe-tumake on anteriorisen aivorungon tumake, jossa sijaitsee merkittävin mielialaa ja käyttäytymistä säätelevien serotonergisten hermosolujen keskittymä. Niiden aktiivisuutta säätelevät dorsaalisen raphe-tumakkeen GABAergiset inhibitoriset ja glutamatergiset eksitatoriset hermosolut. Hermosolujen toiminnan taustalla on niille ominaisten geenien luenta. Yksilöllisten geeniyhdistelmien ilmentyminen vaikuttaa hermosolujen erilaistumiseen ja vaeltamiseen sikiönkehityksen aikana sekä määrää solujen lopullisen identiteetin. Kehitysgenetiikan tutkimusmenetelmin on selvitetty hermosoluille ominaisia merkkigeenejä sekä seurattu solujen vaeltamista kehityksen aikana, mutta dorsaalisen raphe-tumakkeen GABAergisten hermosolujen alkuperä tunnetaan vielä huonosti.
Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää geneettisellä solulinjakartoituksella dorsaalisen raphe-tumakkeen GABAergisten hermosolujen alkuperää hiiren sikiössä Pax7-geeniin kytkettyä Cre-rekombinaasia hyödyntäen. Tutkimuksessa käytettiin Pax7Cre- ja ROSA26TdTomato-muuntogeenisten hiirilinjojen risteytysten sikiöitä kehityksen vaiheissa E12.5 ja E18.5. Sikiöiden Pax7-geeniä ilmentävissä soluissa Cre-rekombinaasi poistaa TdTomato-geeniä edeltävän loxP-sekvenssien ympäröimän lopetuskodonin, jolloin TdTomato ilmentyy ja tuottaa RFP-merkkiproteiinia. RFP leimaa rekombinaasin toiminnan seurauksena Pax7-geeniä ilmentävät solut, ja RFP:n vasta-aineella voidaan kartoittaa Pax7-geeniä ilmentävien solujen liikkumista sikiönkehityksen aikana. Pax7 toimi tässä tutkimuksessa merkkigeeninä dorsaalisessa hermostoputkessa syntyneille hermosoluille. Sikiöt kerättiin eri kehityksen vaiheissa, fiksoitiin paraformaldehydissä ja säilytettiin parafiinissa. Kudoksesta leikattiin mikrotomilla leikesarjoja, jotka värjättiin immunohistokemiallisesti vasta-aineilla tai RNA in situ –hybridisaatiolla komple-mentaarisilla RNA-koettimilla. Vasta-aineet ja koettimet valittiin aiemmissa tutki-muksissa löydettyjen GABAergisissä hermosoluissa ilmentyvien merkkigeenien perusteella, joita olivat Pax7:n lisäksi Gad1, Ntn1, Pitx2 ja Foxo1.
Sikiön dorsaalisessa raphe-tumakkeessa kehitysvaiheessa E18.5 esiintyi runsaasti Gad1-geeniä ilmentäviä GABAergisiä hermosoluja, joista osa vaikutti olevan RFP-positiivisia. GABAergisten hermosolujen joukossa esiintyi Ntn1-geeniä ilmentäviä Gad1-positiivisia hermosoluja, jotka vaikuttivat tutkimusten perusteella olevan myös RFP-positiivisia. Lisäksi kehitysvaiheen E12.5 sikiön ventraalisen rombomeeri 1:n alueella esiintyi Ntn1-geeniä ilmentäviä soluja, joista osa oli myös Pitx2-, Pax7- ja RFP-positiivisia. Tutkimustulokset olivat yhteneväisiä aiempien tutkimusten kanssa ja tukivat hypoteesia, että dorsaalisen raphe-tumakkeen GABAergisillä hermosoluilla on dorsaalinen alkuperä. Tutkimus lisäsi ymmärrystä GABAergisten hermosolujen monimuotoisuuden kehitty-misestä sikiönkehityksen aikana, ja voi toimia jatkossa pohjana myös uusille kehitys- ja neurogeneettisille tutkimuksille.
Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää geneettisellä solulinjakartoituksella dorsaalisen raphe-tumakkeen GABAergisten hermosolujen alkuperää hiiren sikiössä Pax7-geeniin kytkettyä Cre-rekombinaasia hyödyntäen. Tutkimuksessa käytettiin Pax7Cre- ja ROSA26TdTomato-muuntogeenisten hiirilinjojen risteytysten sikiöitä kehityksen vaiheissa E12.5 ja E18.5. Sikiöiden Pax7-geeniä ilmentävissä soluissa Cre-rekombinaasi poistaa TdTomato-geeniä edeltävän loxP-sekvenssien ympäröimän lopetuskodonin, jolloin TdTomato ilmentyy ja tuottaa RFP-merkkiproteiinia. RFP leimaa rekombinaasin toiminnan seurauksena Pax7-geeniä ilmentävät solut, ja RFP:n vasta-aineella voidaan kartoittaa Pax7-geeniä ilmentävien solujen liikkumista sikiönkehityksen aikana. Pax7 toimi tässä tutkimuksessa merkkigeeninä dorsaalisessa hermostoputkessa syntyneille hermosoluille. Sikiöt kerättiin eri kehityksen vaiheissa, fiksoitiin paraformaldehydissä ja säilytettiin parafiinissa. Kudoksesta leikattiin mikrotomilla leikesarjoja, jotka värjättiin immunohistokemiallisesti vasta-aineilla tai RNA in situ –hybridisaatiolla komple-mentaarisilla RNA-koettimilla. Vasta-aineet ja koettimet valittiin aiemmissa tutki-muksissa löydettyjen GABAergisissä hermosoluissa ilmentyvien merkkigeenien perusteella, joita olivat Pax7:n lisäksi Gad1, Ntn1, Pitx2 ja Foxo1.
Sikiön dorsaalisessa raphe-tumakkeessa kehitysvaiheessa E18.5 esiintyi runsaasti Gad1-geeniä ilmentäviä GABAergisiä hermosoluja, joista osa vaikutti olevan RFP-positiivisia. GABAergisten hermosolujen joukossa esiintyi Ntn1-geeniä ilmentäviä Gad1-positiivisia hermosoluja, jotka vaikuttivat tutkimusten perusteella olevan myös RFP-positiivisia. Lisäksi kehitysvaiheen E12.5 sikiön ventraalisen rombomeeri 1:n alueella esiintyi Ntn1-geeniä ilmentäviä soluja, joista osa oli myös Pitx2-, Pax7- ja RFP-positiivisia. Tutkimustulokset olivat yhteneväisiä aiempien tutkimusten kanssa ja tukivat hypoteesia, että dorsaalisen raphe-tumakkeen GABAergisillä hermosoluilla on dorsaalinen alkuperä. Tutkimus lisäsi ymmärrystä GABAergisten hermosolujen monimuotoisuuden kehitty-misestä sikiönkehityksen aikana, ja voi toimia jatkossa pohjana myös uusille kehitys- ja neurogeneettisille tutkimuksille.