Evaluating the possibilities and limitations of cyanobacterial hosts for future biotechnological applications

Abstract

Carbon neutral solutions and circular economy are a relevant part of a sustainable future. Solutions based on photosynthetic cyanobacteria have potential due to several facts: i) Cyanobacteria can produce target compounds directly from CO2 and H2O using sunlight. ii) The expanding synthetic biology toolset allows the modifications of native pathways and even the introduction of entire heterologous pathways. iii) Many strains can tolerate harsh conditions and they do not compete for prime land areas with agriculture. Cyanobacteria are more complex biotechnological production platforms compared to traditional heterotrophic bacteria, and therefore a combination of basic research and synthetic biology is required. The work presented in this thesis combines basic research of native hydrocarbon metabolism to the applied utilization of cyanobacteria for heterologous ethylene production. In addition, the host cell properties of two different cyanobacterial strains were compared and, according to the principles of circular bioeconomy, a fermentative waste product was studied as an alternative carbon source for biomass production.

The gained results highlight the unexpected importance of native hydrocarbons to cyanobacterial cells. Saturation and quantity of the aliphatic hydrocarbons is strictly controlled and membrane associated, while lack of hydrocarbons resulted in distorted growth and reduced photosynthetic activity, carbon fixation and the floating capacity of cells, which are important features for survival of photosynthetic organism in native aquatic environments. Ethylene, on the other hand, can be produced via the introduced ethylene forming enzyme. An alternative expression strategy enabled long-term ethylene production in two different host strains without the previously encountered loss of viability. Furthermore, both the original and modified gene sequence of efe enabled similar ethylene production in both hosts. This highlights the importance of taking into consideration strain-specific variations when designing production systems. Another important feature in production system design is the flexible use of alternative carbon sources which can function as a backup when light is limited and increase biomass accumulation. The potential for the utilization of acetate was studied as well, and the addition of an acetate transporter was observed to increase acetate intake. This was especially beneficial for cell growth under low light conditions, despite it being accompanied by alterations in photosynthetic activity and intracellular storage compounds.

Hiilineutraalit ratkaisut ja kiertotalous ovat oleellinen osa kestävää kehitystä. Yhteyttäviin sinileviin pohjautuvalla bioteknologialla on useita etuja: i) Sinilevät pystyvät tuottamaan haluttuja yhdisteitä suoraan hiilidioksidista ja vedestä auringonvalon avulla. ii) Synteettisen biologian välineistön kehittyessä luontaisia aineenvaihdunta reitistöjä on mahdollista muokata ja uusia lisätä. iii) Monet kannat kestävät karujakin olosuhteita, eivätkä sinilevät kilpaile maatalouden kanssa hyvästä kasvualasta. Sinilevät ovat paljon monimutkaisempia organismeja kuin perinteiset, pieteetillä karakterisoidut, bakteereihin ja hiivoihin pohjautuvat tuottosysteemit, joten ne edellyttävät synteettisen biologian ja perustutkimuksen yhdistelemistä. Tämä väitöskirja käsittelee luontaisten hiilivetyjen merkityksen selvittämistä perustutkimuksen menetelmin ja solujen käyttöä solutehtaina lisätyn etyleenin tuottoreitin avulla. Lisäksi tutkimuksissa vertailtiin kahta sinileväkantaa isäntäsoluina ja sovellettiin kiertotalouden periaatteita käyttämällä käymistuotteena muodostuvaa asetaattia vaihtoehtoisena energian lähteenä biomassan lisäämiseksi.

Tulokset osoittivat luontaisten alifaattisten hiilivetyjen merkityksen sinileville. Hiilivetyjen saturaatio ja määrä ovat tarkoin säädeltyjä ja yhteydessä solukalvoihin ja niiden puuttuminen vaikutti solujen kasvuominaisuuksiin sekä heikensi yhteyttämistä, hiilensidontaa ja solujen kellumista, jotka ovat tärkeitä ominaisuuksia yhteyttäville eliöille vesistöissä. Etyleenin tuotto puolestaan onnistuu lisätyn EFE–entsyymin avulla. Uudella tuottostrategialla pitkäaikainen etyleenin tuotto mahdollistettiin kahteen eri sinileväkantaan, ilman aikaisempaa isäntäsolun kärsimistä. Erilaisia efe-geenin variaatioita vertaamalla päästiin samoihin tuottomääriin ilman aikaisemmin käytössä olleita muokkauksia. Nämä tulokset korostivat sinileväkantojen välisiä eroja, joiden ottaminen huomioon on erityisen tärkeää tuotantostrategioita suunnitellessa. Suunnittelussa on tärkeää huomioida myös vaihtoehtoisten hiililähteiden joustava käyttö. Sekä biomassan lisäämisen että valon saatavuuden hetkellisten rajoitteiden vuoksi tutkittiin asetaatin käyttöä vaihtoehtoisena hiililähteenä. Asetaatti transportterin lisäys mahdollisti asetaatin tehokkaamman sisäänoton, joka lisäsi kasvua erityisesti vähäisessä valossa, vaikka aiheuttikin muutoksia myös solujen yhteyttämisaktiivisuuteen ja solun sisäisiin varastomolekyyleihin.