Treatment of herpes simplex virus infection using antiviral siRNA swarms with 2’-fluoro-modifications
Kalke, Kiira (2020-04-28)
Treatment of herpes simplex virus infection using antiviral siRNA swarms with 2’-fluoro-modifications
(28.04.2020)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
avoin
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2020062245295
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2020062245295
Tiivistelmä
Herpes simplex virus 1 (HSV-1) is a very common pathogen. Besides mostly harmless oral lesions, HSV-1 causes severe diseases such as neonatal herpes, herpes encephalitis and herpes keratitis, the primary cause of infectious blindness worldwide. The available anti-herpes chemotherapy is efficient but depends on a functional viral thymidine kinase. Long-term treatment, required especially in severe diseases, promotes emergence of thymidine kinase mutant strains. These strains are multi-drug resistant, and may lead to dangerous untreatable exacerbations, demonstrating an evident unmet medical need.
Small interfering RNA (siRNA) swarms are a novel antiviral approach with extensive tolerance for pathogen mutations. In contrast to regular siRNAs targeting around twenty nucleotides, swarms can target thousands, and thus overcome major challenges of regular antiviral-siRNAs, such as emergence of resistant mutant strains. The most extensively studied siRNA swarm target is the essential UL29 gene of HSV-1. The UL29 targeting siRNA swarm has proven antiviral efficacy against multiple patient-derived strains in vitro and significant inhibition of virus replication in vivo. Here, the swarm is improved by 2’-fluoro-modifications to achieve advanced stability and potency. In this Master’s thesis, effects of incorporated 2’-fluoro-nucleotides on cellular tolerability, host responses and antiviral efficacy are studied in vitro.
According to the results, the modified siRNA swarms are well tolerated and demonstrate high antiviral efficacy in prophylactic and therapeutic settings in vitro. The modified siRNA swarms were better than or equal to the nonmodified siRNA swarms in every studied aspect. Overall, the results encourage for subsequent in vivo experiments utilizing the modified siRNA swarms. Herpes simplex virus tyyppi 1 (HSV-1) on yleinen taudinaiheuttaja, joka tunnetaan parhaiten aiheuttamistaan epämiellyttävistä ja toistuvista yskänrokoista. HSV-1 voi kuitenkin aiheuttaa myös vakavampia tautitiloja, kuten sarveiskalvontulehdusta. HSV-1:n aiheuttama sarveiskalvontulehdus on maailman yleisin sokeuteen johtava infektioperäinen sairaus, johon nykyinen lääkehoito on riittämätön.
Herpesinfektioiden nykyinen lääkehoito on tehokasta, mutta edellyttää viruksen oman tymidiinikinaasigeenin toimintaa. Erityisesti vakavammissa sairauksissa vaadittava pitkäaikainen ja ennaltaehkäisevä lääkehoito voi johtaa tymidiinikinaasimutatoituneiden viruskantojen ilmaantumiseen. Nämä lääkeresistentit viruskannat ovat selkeä puute nykyisessä lääkehoidossa, ja siten tärkeä lääkekehityskohde.
Pienet häiritsevät RNA:t eli siRNA:t (engl. small interfering RNA) johtavat geenien hiljentymiseen. Niitä voidaan käyttää estämään virusten lisääntymistä kohdistamalla siRNA:t kohdeviruksen välttämättömään geeniin. Tavallisesti siRNA:t on kohdistettu verrattain lyhyeen sekvenssijaksoon. Pieni kohdealue altistaa tehon menetykseen joko lähisukuisten virusten perimän monimuotoisuuden vuoksi tai mutaation kautta. SiRNA-parvet tuotetaan entsymaattisesti pitkästä kohdealueesta, jolloin niiden teho kattaa viruskantojen monimuotoisuuden ja mahdolliset mutaatiot kohdesekvenssissä. SiRNA-parvia on tutkittu lääkkeenä herpesinfektioon sekä in vitro että in vivo erittäin lupaavin tuloksin. SiRNA:t kuitenkin hajoavat nopeasti elimistössä, mikä vähentää hoitomuodon potentiaalia, annostelutavasta riippuen. SiRNA:n kestävyyttä pystytään kuitenkin parantamaan kemiallisilla modifikaatioilla.
Tässä Pro Gradu -tutkielmassa selvitettiin siRNA-parviin sisällytettyjen 2’-fluoro-nukleotidien vaikutusta parvien tehoon herpestä vastaan in vitro. Lisäksi selvitettiin solujen luonnollisen immuniteetin vaste muunnelluille siRNA-parville. Tutkimuksissa käytetyt solulinjat edustivat hermostoa ja sarveiskalvoa, jotka ovat olennaisia herpesinfektion kohdekudoksia. Muunnellut siRNA-parvet ovat tulosten perusteella vähintään yhtä turvallisia ja jopa tehokkaampia kuin perinteiset siRNA-parvet. Molempien parvityyppien havaittiin lisäksi estävän virusinfektiota ainakin viiden vuorokauden ajan kerta-annostelun jälkeen. Tulokset valottavat perinteisten ja erityisesti muunneltujen siRNA-parvien potentiaalia terapeuttisena ja ennaltaehkäisevänä lääkehoitomuotona ja kannustavat niiden jatkotutkimuksiin in vivo.
Small interfering RNA (siRNA) swarms are a novel antiviral approach with extensive tolerance for pathogen mutations. In contrast to regular siRNAs targeting around twenty nucleotides, swarms can target thousands, and thus overcome major challenges of regular antiviral-siRNAs, such as emergence of resistant mutant strains. The most extensively studied siRNA swarm target is the essential UL29 gene of HSV-1. The UL29 targeting siRNA swarm has proven antiviral efficacy against multiple patient-derived strains in vitro and significant inhibition of virus replication in vivo. Here, the swarm is improved by 2’-fluoro-modifications to achieve advanced stability and potency. In this Master’s thesis, effects of incorporated 2’-fluoro-nucleotides on cellular tolerability, host responses and antiviral efficacy are studied in vitro.
According to the results, the modified siRNA swarms are well tolerated and demonstrate high antiviral efficacy in prophylactic and therapeutic settings in vitro. The modified siRNA swarms were better than or equal to the nonmodified siRNA swarms in every studied aspect. Overall, the results encourage for subsequent in vivo experiments utilizing the modified siRNA swarms.
Herpesinfektioiden nykyinen lääkehoito on tehokasta, mutta edellyttää viruksen oman tymidiinikinaasigeenin toimintaa. Erityisesti vakavammissa sairauksissa vaadittava pitkäaikainen ja ennaltaehkäisevä lääkehoito voi johtaa tymidiinikinaasimutatoituneiden viruskantojen ilmaantumiseen. Nämä lääkeresistentit viruskannat ovat selkeä puute nykyisessä lääkehoidossa, ja siten tärkeä lääkekehityskohde.
Pienet häiritsevät RNA:t eli siRNA:t (engl. small interfering RNA) johtavat geenien hiljentymiseen. Niitä voidaan käyttää estämään virusten lisääntymistä kohdistamalla siRNA:t kohdeviruksen välttämättömään geeniin. Tavallisesti siRNA:t on kohdistettu verrattain lyhyeen sekvenssijaksoon. Pieni kohdealue altistaa tehon menetykseen joko lähisukuisten virusten perimän monimuotoisuuden vuoksi tai mutaation kautta. SiRNA-parvet tuotetaan entsymaattisesti pitkästä kohdealueesta, jolloin niiden teho kattaa viruskantojen monimuotoisuuden ja mahdolliset mutaatiot kohdesekvenssissä. SiRNA-parvia on tutkittu lääkkeenä herpesinfektioon sekä in vitro että in vivo erittäin lupaavin tuloksin. SiRNA:t kuitenkin hajoavat nopeasti elimistössä, mikä vähentää hoitomuodon potentiaalia, annostelutavasta riippuen. SiRNA:n kestävyyttä pystytään kuitenkin parantamaan kemiallisilla modifikaatioilla.
Tässä Pro Gradu -tutkielmassa selvitettiin siRNA-parviin sisällytettyjen 2’-fluoro-nukleotidien vaikutusta parvien tehoon herpestä vastaan in vitro. Lisäksi selvitettiin solujen luonnollisen immuniteetin vaste muunnelluille siRNA-parville. Tutkimuksissa käytetyt solulinjat edustivat hermostoa ja sarveiskalvoa, jotka ovat olennaisia herpesinfektion kohdekudoksia. Muunnellut siRNA-parvet ovat tulosten perusteella vähintään yhtä turvallisia ja jopa tehokkaampia kuin perinteiset siRNA-parvet. Molempien parvityyppien havaittiin lisäksi estävän virusinfektiota ainakin viiden vuorokauden ajan kerta-annostelun jälkeen. Tulokset valottavat perinteisten ja erityisesti muunneltujen siRNA-parvien potentiaalia terapeuttisena ja ennaltaehkäisevänä lääkehoitomuotona ja kannustavat niiden jatkotutkimuksiin in vivo.