Strategies for analyzing the regio- and stereospecific structures of individual triacylglycerols in natural fats and oils

Abstract

Food lipids are mainly found in the form of triacylglycerols (TAG) containing three structurally identical or different fatty acids. The positional distribution of fatty acids is under genetic control. In TAG biosynthesis, fatty acids are specifically esterified in glycerol in enzyme-catalyzed reactions resulting in distinctive TAG species that are not randomly built. The chiral nature of other macromolecules in food, such as proteins and carbohydrates, is well established in science but the chirality of lipids and their functions has been a long-standing question. The aim of this work is to contribute to this research area of chirality by giving fresh insights into new methods and chromatographic retention behavior of TAGs, and to study the detailed molecular structure of individual TAGs in natural fats and oils.

Novel chromatographic methods (RP- and chiral-phase HPLC) combined with mass spectrometry (MS) were used in the practical work for separation and identification of regioisomers (the positional distribution of fatty acids between the positions sn-2 and sn-1/3) and enantiomers (the positional distribution of fatty acids in the positions sn-1, sn-2, sn-3) of nutritionally important TAGs. ESI-MS/MS and NIAPCI-MS/MS were applied to study the regiospecific composition of TAGs in human milk, and ammonia NICI-MS and MS/MS to confirm the enantiospecific structures of TAGs of sea buckthorn pulp oil as the model food component. The studies included development of a chiral chromatographic method based on sample recycling.

The suitability of different MS/MS methods in the analysis of TAG regioisomers was investigated. Overall, the results revealed new information about the methodology and the chiral elution behavior of TAGs. The chiral-phase [2 × cellulose tris-(3,5-dimethylphenylcarbamate)] recycling HPLC method in a polar-organic phase enabled resolution of 17 out of the 21 enantiopairs of TAGs studied. Presence of both saturated and unsaturated fatty acid favored the separation by the chiral columns. A TAG enantiomer with an unsaturated FA in the sn-1 position eluted ahead of its enantiomer despite the length of carbon chains or the number of DBs. Within the TAG regioisomer 16:1-16:1-16:0 in sea buckthorn pulp oil, the enantiomeric ratio of sn-16:1-16:1-16:0 to TAG sn-16:0-16:1-16:1 was 70.5:29.5. Overall, the results clearly showed the non-random positional distribution of natural FAs, and the abundance of unsaturated FAs in the position sn-2, which is common in plant oils. The other most abundant TAG species included mainly TAGs with three different FAs, which were not possible to analyze with the current methodology. The method developed during the PhD project was also successfully applied to an enantiomeric purity assessment of synthesized TAGs.

Despite the promising progress in the stereospecific analysis of individual TAGs the elution order of TAG enantiomers is challenging to predict due to the complicated intermolecular forces involved in chiral recognition mechanisms. All new information concerning chiral retention behavior is essential for further development in the field. Chiral phase liquid chromatography combined with mass spectrometric analysis proved to be a reliable method for analysis of lipid stereoisomers in food and other biological systems. These results offer valuable information and a reliable tool to study specific positional distribution of fatty acids in natural samples and can be applied to studies of both food composition and nutritional aspects.

Elintarvikkeiden lipidit koostuvat pääosin triasyyliglyseroleista, joissa on kolme samanlaista tai erilaista rasvahappoa. Rasvahappojen paikkajakauma on geneettisesti säädelty. Rasvahapot ovat esteröityneet glyseroliin entsyymikatalysoidussa triasyyliglyserolien biosynteesissä muodostaen kombinaatioita, jotka eivät ole sattumanvaraisia. Muiden ravinnon makromolekyylien kuten proteiinien ja hiilihydraattien kiraalisuus tunnetaan tieteessä jo varsin hyvin, ja myös lipidien kolmiulotteisia rakenteita ja niiden vaikutuksia on pyritty selvittämään jo vuosikymmenten ajan. Tutkimustyön tavoitteena oli kehittää rasvojen kiraalisuuden tutkimusta, soveltaa uusia menetelmiä triasyyliglyserolien kromatografisen retentiokäyttäytymisen selvittämiseen sekä tutkia luonnon rasvojen ja öljyjen yksittäisten triasyyliglyserolien yksityiskohtaista molekyylirakennetta.

Nykyaikaisia kromatografisia menetelmiä (käänteisfaasi- ja kiraalifaasinestekromatografia) yhdistettyinä massaspektrometriaan (MS) käytettiin ravitsemuksellisesti tärkeiden triasyyliglyserolien regioisomeerien (rasvahappojen paikkajakauma asemien sn-2 and sn-1/3 välillä) ja enantiomeerien (rasvahappojen paikkajakauma asemien sn-1, sn-2 and sn-3 välillä) erottamiseen ja tunnistamiseen. Regiospesifisessä analyysissä sovellettiin eri massaspektrometrimenetelmiä (ESI-MS/MS ja NIAPCI-MS/MS) äidinmaidon triasyyliglyserolien tutkimiseen. Ammoniakki NICI-MS- and MS/MS -menetelmien avulla varmistettiin mallielintarvikkeena tutkitun tyrnimarjan hedelmälihan öljyn triasyyliglyserolirakenteet enantiospesifisessä analyysissä. Lisäksi kehitettiin näytteen kierrätykseen perustuva kiraalikromatografinen menetelmä.

Tutkimuksessa tarkasteltiin eri massaspektrometristen menetelmien soveltuvuutta triasyyliglyserolien regiospesifiseen analyysiin. Kokonaisuudessaan tuloksena saatiin uutta tietoa menetelmistä ja yhdisteiden eluutiokäyttäytymisestä kiraalisessa ympäristössä. Tutkitusta 21:stä triasyyliglyserolista 17:sta saatiin enantiomeerit erotettua toisistaan käyttäen näytteen kierrätykseen perustuvaa nestekromatografiaa, jossa oli kiraalinen stationaarifaasi [2 × selluloosa tris-(3,5-dimetyylifenyylikarbamaatti)] ja eluenttina metanoli. Asymmetristen triasyyliglyserolien tyydyttynyt ja tyydyttymätön rasvahappo edistivät erottumista. Enantiomeeri, jossa tyydyttymätön rasvahappo oli asemassa sn-1, eluoitui toista enantiomeeria nopeammin hiiliketjun pituudesta tai kaksoissidosten lukumäärästä riippumatta. Yhdisteen sn-16:1-16:1-16:0 suhde sen sn-16:0-16:1-16:1 enantiomeeriin oli tyrnimarjan hedelmälihassa 70,5:29,5. Kokonaisuudessaan tulokset osoittivat selvästi luonnon rasvahappojen ei-sattumanvaraisen paikkajakauman ja tyydyttymättömien rasvahappojen runsauden asemassa sn-2, mikä on tyypillistä kasviöljyille. Muut merkittävimmät jakeet koostuivat pääsiassa kolme erilaista rasvahappoa sisältävistä triasyyliglyseroleista, joiden analysoiminen ei ollut mahdollista tässä tutkimuksessa käytetyllä menetelmällä. Väitöskirjatyössä kehitetyn menetelmän osoitettiin olevan tehokas myös synteesituotteiden enantiopuhtauden määrittämisessä.

Vaikka yksittäisten triasyyliglyserolien yksityiskohtaisen molekyylirakenteen analysointi on viime vuosikymmenen aikana huomattavasti kehittynyt, on haasteellista ennustaa enantiomeerien eluutiokäyttäytymistä johtuen monimutkaisista molekyylien välisistä kiraalisista vuorovaikutuksista. Yhdisteiden retentiokäyttäytymisen perusteellinen selvittäminen on välttämätöntä jatkokehityksen kannalta. Kiraalinen nestekromatografia yhdistettynä massaspektrometriaan tarjoaa luotettavan menetelmän ravinnon ja muiden biologisten matriisien lipidien isomeerien analysoimiseen. Tuloksena saatiin arvokasta tietoa ja luotettava menetelmä luonnon rasvojen ja öljyjen yksityiskohtaisen paikkajakauman tutkimiseen. Tulevaisuudessa menetelmää voidaan soveltaa niin elintarvike- kuin ravitsemustutkimuksissa.