Structure elucidation and ruminant-related bioactivities of purified proanthocyanidins

Abstract

In this thesis work, a group of natural oligomers and polymers called proanthocyanidins was studied via multiple chemical approaches. At first, the proanthocyanidins were purified from eleven Finnish plant species with a liquid chromatography method developed during this work. The structures of the purified proanthocyanidins were studied with mass spectrometry, which showed that the proanthocyanidins were successfully isolated from the original complex mixture of compounds into substantially simpler fractions. In the second study of this work, the bioactivities of these fractions were measured by determining their protein precipitation capacity. The results showed that the polymeric size of the proanthocyanidins was the most significant structural feature increasing their ability for protein precipitation. Other structural features were significant as well, yet their relevance to the protein precipitation capacity differed significantly amongst the tested plant species.

In the third study, the anthelmintic activities of the purified proanthocyanidins were studied in vitro against gastrointestinal parasite Ascaris suum. The effectiveness of these compounds was tested as migration inhibition activity and mortality. The results showed, that increasing polymeric size increased the anthelmintic activity of proanthocyanidins and clear differences were observed between the tested plant species as well. The similarities of the aforementioned results supported the hypothesis that the anthelmintic activities of proanthocyanidins could take place via their interactions with proteins.

Lastly, the impact of different ensiling procedures on the proanthocyanidin composition of Vicia faba was studied. The total proanthocyanidin concentration decreased after each treatment, and especially the amount of soluble proanthocyanidins decreased substantially. Possible explanations for the decrease of proanthocyanidin levels are either degradation of proanthocyanidins during the ensiling processes or their transformation into non-soluble forms.

Puhdistettujen proantosyanidiinien rakennemääritys ja märehtijöihin liittyvät bioaktiivisuudet

Tässä väitöskirjatyössä perehdyttiin proantosyanidiinien, tutkimukseen erilaisin kemiallisin menetelmin. Työhön valittiin 11 suomalaista kasvilajia, joista tutkittavat yhdisteet eristettiin. Aluksi proantosyanidiinit puhdistettiin tässä työssä kehitetyllä nestekromatografisella menetelmällä, mitä seurasi eristettyjen proantosyanidiinien rakenteen tarkka määritys massaspektrometrian avulla. Nämä mittaukset osoittivat, että proantosyaniidinit kyettiin erottamaan toisistaan tehokkaasti alkuperäistä yhdisteseosta huomattavaksi yksinkertaisemmiksi jakeiksi. Työn toisessa osassa puhdistettujen jakeiden bioaktiivisuus määritettiin niiden proteiininsaostuskykyä mittaamalla. Tulokset osoittivat proantosyanidiinien koon olevan merkittävin rakenteellinen tekijä, joka lisäsi niiden aktiivisuutta. Myös muiden rakenteellisten ominaisuuksien todettiin olevan merkittäviä, mutta näiden vaikutuksen suuruus vaihteli merkittävästi eri kasvilajeilla.

Työn kolmannessa osassa puhdistettujen proantosyanidiinien antiloisaktiivisuutta arvioitiin Ascaris suum -suolistoloista vastaan in vitro -tutkimuksessa. Tutkimus suoritettiin tarkastelemalla, miten tehokkaasti proantosyanidiinikäsittely inhiboi loisten kulkeutumista agar-geelissä sekä, miten tehokkaasti käsittely tappoi loisia. Antiloismittausten tulokset olivat samansuuntaisia kuin proteiininsaostuskyvyn tapauksessa. Proantosyanidiinien suuren koon havaittiin olevan merkittävä aktiivisuutta lisäävä tekijä, minkä lisäksi erot aktiivisuudessa kasvilajien välillä olivat merkittäviä. Niin proteiininsaostus kuin antiloismittausten tulosten samankaltaisuus tuki hypoteesia, jonka mukaan proantosyanidiinien antiloisaktiivisuusmekanismi liittyy niiden kykyyn vuorovaikuttaa proteiinien kanssa.

Työn viimeisessä osassa tutkittiin eri säilöntämenetelmien vaikutusta härkäpavun (Vicia faba) proantosyanidiinipitoisuuteen ja -koostumukseen. Proantosyanidiinipitoisuus väheni kokonaisuudessaan merkittävästi kaikissa käsittelyissä, sekä erityisesti liukoisten proantosyanidiinien määrä laski merkittävästi. Mahdollisia syitä vähentyneelle proantosyanidiinipitoisuudelle olivat joko niiden hajoaminen tai muuntuminen liukenemattomaan muotoon.