Bioprocessing of berry materials with malolactic fermentation

Abstract

Malolactic fermentation is used by wine industry to decrease acidity and introduce odor compounds through the metabolic activity of ethanol-tolerant lactic acid bacteria. In this work, this oenological approach was used to modify flavor chemistry of berry materials with low consumer value. The aim was to determine fermentation conditions that lead to effective deacidification and possibly to other chemical changes that would improve sensory and functional properties, and thus consumer value, of various berry materials.

For the practical work of the thesis, juices from sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides L.), chokeberry (× Sorbaronia mitschurinii, old name Aronia mitchurinii) and lingonberry (Vaccinium vitis-idaea L.) were fermentated with multiple strains of Lactiplantibacillus plantarum and Oenococcus oeni, precultivated either in a typical basal medium or in an acclimation medium. Multiple methodologies combining chromatography, mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance spectroscopy were applied for targeted, semi-targeted, and non-targeted analysis of metabolites in the juices before and after fermentation.

While chokeberry juice was fermentable as such, fermentation of natural sea buckthorn juice was ineffective in most cases. However, increasing juice pH from natural 2.7 to 3.5 or acclimating cells prior to inoculation allowed fermentation of sea buckthorn with all studied strains. At the natural pH of sea buckthorn juice, no sugars were fermented or flavonol glycosides metabolized. At the natural pH of chokeberry juice, sugars were fermented along with malic acid, and quercetin glycosides, chlorogenic acid, and other phenolic acids present in the juice were metabolized by L. plantarum. All fermentations that used lingonberry as raw material failed due to the high content of benzoic acid.

During fermentation of sea buckthorn and chokeberry, the metabolism of malic acid yielded mainly lactic acid, while the metabolism of quinic acid led to the formation of protocatechuic acid, catechol, shikimic acid, and 3,4,5- trihydroxy-1-cyclohexanoic acid. Other microbe-related metabolites detected in the fermented sea buckthorn juice were acetic acid, ethanol, isovaleric acid, phenyllactic acid, succinic acid, 1,3-dihydroxyacetone, trehalose, maltose, GABA, and oxaloacetic acid. It was concluded that depending on the strain of L. plantarum, acetate production during the fermentation of sea buckthorn juice was supported by the production of ethanol or succinic acid, or quinic acid metabolism, to consume excess NADH.

Nearly all the identified volatile compounds from sea buckthorn juice were esters with a fruity descriptor. Fermentation with L. plantarum increased the content of volatile acids, i.e. acetic acid, 3-methylbutanoic acid, and free fatty acids as well as the content of buttery ketones (acetoin) and various alcohols. While the concentration of fruity esters was decreased during fermentation, the content of benzyl alcohol (floral) and 2-undecanone (fruity) were increased. The content of fatty-acid derived aldehydes was decreased in all fermented samples.

In summary, fermenting sea buckthorn juice for a shorter period (36 h) and at a lower pH (2.7) led to an effective deacidification via malolactic fermentation without the consumption of sugars. Reducing fermentation time resulted to a decrease in formation of volatile acids and less loss of ester compounds present in the juices. On the other hand, fermentation for longer time (72 h) and at an elevated pH (3.5) led to stronger protection of ascorbic acid from oxidation, greater formation of antimicrobial compounds (3-phenyllactic acid, acetic acid, lactic acid), and greater metabolism of secondary metabolites (phenolic compound and quinic acid metabolism). These results can be applied to the product development of novel fermented

Viiniteollisuus hyödyntää laajasti viinien happamuuden vähentämiseksi ja aromin muokkaamiseksi malolaktista fermentaatiota, jonka taustalla ovat etanolia sietävät maitohappobakteerit. Tässä työssä tätä viiniteollisuuden lähestysmistapaa hyödynnettiin haastavanmakuisten marjojen maku- ja aromikemian muokkaamiseen. Työn tavoitteena oli selvittää ne fermentaatioolosuhteet, joissa marjojen happamuuden vähentäminen ja muut aistittavan laadun kannalta positiiviset muutokset kemiallisessa koostumuksessa saadaan aikaan mahdollisimman tehokkaasti.

Väitöskirjan kokeellisessa osassa tutkittiin soveltuvatko tyrnimarjasta (Hippophaë rhamnoides L.), marja-aroniasta (× Sorbaronia mitschurinii, vanha nimi Aronia mitchurinii), ja puolukasta (Vaccinium vitis-idae L.) valmistetut mehut raaka-aineeksi malolaktiseen fermentaatioon. Mikrobeina käytettiin useita eri kantoja lajeista Lactiplantibacillus plantarum ja Oenococcus oeni. Mehut valmistettiin joko ilman tai entsyymikäsittelyn avustamana. Solukasvatukset tuotettiin tyypillisessä elatusaineessa tai sopeutusliuoksessa. Työssä hyödynnettiin laajasti erilaisia analyyttisiä työkaluja, joihin lukeutuvat erilaiset kromatografiset menetelmät, massaspektrometria, ja ydinmagneettinen resonanssispektroskopia. Kohdennettuilla, osin kohdennettuilla ja kohdentamattomilla analyyseillä määritettiin muutokset fermentaation kannalta olennaisten aineenvaihduntatuotteiden koostumuksessa.

Mikrobit pystyivät fermentoimaan aroniamehua sellaisenaan, mutta muokkamattoman tyrnimehun fermentaatio onnistui vain vaihtelevasti. Tyrnimehun pH:n nosto 2.7:stä 3.5:een ja solujen sopeutus happamiin olosuhteisiin ennen fermentaatiota mahdollisivat onnistuneen fermentaation kaikilla testikannoilla. Kun tyrnimehua fermentoitiin ilman pH:n säätöä, mikrobit eivät metaboloineet sokereita tai tyrnimehun flavonoliglykosideja. Sen sijaan L. plantarum metaboloi aroniamehun sokereita, kversetiini glykosideja, klorogeniinihappoa ja fenolisia happoja myös mehun luontaisessa pH:ssa. Puolukan fermentaatio epäonnistui kaikissa testiolosuhteissa, mikä johtui puolukkamehun korkeasta bentsoehappopitoisuudesta.

Omenahapon aineenvaihdunta tuotti pääasiassa maitohappoa sekä aronia- että tyrnimehussa, kun taas kviinihapon metabolia tuotti protokatekiinihappoa, sikimihihappoa ja 3,4,5-trihydroksi-1-sykloheksaanihappoa. Muita mikrobiperäisiä metaboliitteja, joita fermentoidusta tyrnimehusta tunnistettiin, olivat etikkahappo, etanoli, isovaleriaanahappo, fenyylimaitohappo, meripihkahappo, dihydroksiasetoni, trehaloosi, maltoosi, γ-aminovoihappo, ja oksaloetikkahappo. Tuloksista selvisi, että kannasta riippuen tyrnimehun fermentaation aikana L. plantarum tuotti etanolia tai meripihkahappoa, taimetaboloi kviinihappoa, kuluttamaan ylimääräisen NADH-kofaktorin, jota muodostui asetaatin tuottamisesta.

Valtaosa sekä määrällisesti että koostumuksellisesti tyrnimehusta tunnistetuista haihtuvista yhdisteistä olivat estereitä, joilla on hedelmäinen ominaishaju. Fermentaatio lisäsi haihtuvien happojen määrää, joita olivat tässä tapauksessa etikkahappo ja erilaiset vapaat rasvahapot. Tämän lisäksi fermentaatiossa vapautui asetoiinia, jolla on voimainen ominaishaju. Vaikka hedelmäisten estereiden määrä laski fermentaation aikana, bentsyylialkoholin (kukkainen ominaishaju) ja 2-undekanonin (hedelmäinen ominaishaju) konsentraatiot kasvoivat. Rasvahappoperäisten aldehydien määrät laskivat kaikissa fermentoiduissa mehuissa.

Tuloksista voitiin päätellä, että tyrnimehun fermentointi lyhyemmän ajan (36 t) ja pH:ta muokkaamatta (aloitus-pH 2.7) happamuutta voitiin vähentää tehokkaasti ilman sokerien fermentointia. Lyhyellä fermentaatioajalla oli myös se etu, että tyrnin hedelmäisten esterien määrä tippui vähemmän, ja mehuun ei muodustunut yhtä paljon haihtuvia happoja verrattuna pitkään fermentaatioaikaan (72 t). Kun mehun pH oli korkeampi fermentaation aloitusvaiheessa (3.5) askorbiinihappo hapettui vähemmän fermentaation aikana ja mehuun muodostui enemmän antimikrobisia yhdisteitä (3-fenyylimaitohappo, etikkahappo, maitohappo). Tämän lisäksi korkeammassa pH:ssa mikrobit metaboloivat enemmän sekundäärimetaboliitteja (fenoliset yhdisteet, kviinihappo). Tämän väitöskirjan tuloksia voidaan hyödyntää uudenlaisten fermentoitujen juomien kehittämiseen, joiden raaka-aineena käytetään paljon omenahappoa sisältäviä marja- tai hedelmämateriaaleja.