Dynamic regulation of oxygenic photosynthesis in cyanobacteria by flavodiiron proteins

Abstract

The ability of oxygenic photosynthetic organisms to develop protective mechanisms for the regulation of the photosynthetic apparatus is crucial for their survival in continuously changing environmental conditions. The flavodiiron proteins (FDPs) represent a remarkable regulatory electron transport pathway evolved in all photosynthetic organisms, apart from angiosperms, red and brown algae. The FDPs act as photoprotective electron sinks in directing excess electrons from the photosynthetic electron chain to O2, via the so-called Mehler-like reaction. In this thesis work, I focused on the regulatory mechanism, physiological relevance and functional regulation of FDPs in cyanobacteria.

In the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 (hereafter Synechocystis), the Flv1/Flv3 heterodimer has long been regarded as solely responsible for the Mehler-like reaction downstream of PSI under both high (HC) and air level (low, LC) levels of CO2. In this work, I revealed, for the first time, the contribution of the Flv2/Flv4 heterodimer to the Mehler-like reaction in vivo. Moreover, I directly compare the Mehler-like reaction kinetics under HC and LC conditions. My results demonstrate that, contrary to the apparent futile contribution of FDPs under HC, WT cells display a strong and steady-state Mehler-like reaction (biphasic kinetics) mediated by low amounts of the Flv1/Flv3 heterodimer. Whereas, under LC (at pH 6–8.2), the expression of FDPs is induced and WT cells show triphasic kinetics (induction, quenching and steady-state) of O2 photoreduction driven by Flv1/Flv3 and Flv2/Flv4 functioning downstream of PSI. Furthermore, I was able to unravel the contribution of Flv1/Flv3 and Flv2/Flv4 to the O2 photoreduction kinetics: Flv1/Flv3 was shown to be the main responsible for the strong but transient phase upon illumination, while Flv2/Flv4 mostly contributes to the slow steady-state phase under LC. Importantly, the mutants with defective NDH-1 complexes lacked the quenching phase of O2 photoreduction after the initial induction, suggesting that the transient activity of Flv1/Flv3, under LC, is due to competition for electrons with the NDH-1 complex via reduced Fd. A more thorough examination demonstrated a partial functional redundancy between Flv1/Flv3 and NDH-11/2. Under constant illumination in LC, cells devoid of NDH-11/2 prioritize the oxidation of PSI by enhancing the accumulation and activity of all FDPs, over the efficient induction of CO2 fixation. Under the same conditions, the absence of the transient activity of Flv1/Flv3 can be compensated for by the joint work of NDH 11/2 and Flv2/Flv4 to maintain PSI oxidation. The absence of both Flv1/Flv3 and NDH-11/2 resulted in a diminished ability to oxidize PSI and, albeit at a high cost, this allowed the allocation of reductants towards CO2 fixation. These results demonstrated a dynamic coordination between both pathways for the efficient oxidation of PSI and CO2 fixation. In this work, I also demonstrated that the essential role of Flv1/Flv3 under fluctuating light (FL) conditions cannot be compensated for by neither Flv2/Flv4 nor NDH-1. Additionally, I demonstrated that Flv1/Flv1 and Flv3/Flv3 homodimers contribute to the acclimation of Synechocystis to FL, mediating an oxygen-independent reaction.

The filamentous N2-fixing cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120 (hereafter Anabaena) contains, along with Flv2 and Flv4, two copies of genes encoding for Flv1 and Flv3 proteins: Flv1A and Flv3A are expressed in vegetative cells, whereas Flv1B and Flv3B are localized in mature heterocysts. My results indicate that Flv3A has an important role during light acclimation regardless of the of the nitrogen and CO2 availability. Moreover, I demonstrated that unlike Flv3 in Synechocystis, Flv3A is capable of mediating, to some extent, O2 photoreduction independently of Flv1A. My results suggest that Flv3A functions in coordination with Flv2 and Flv4, likely forming various oligomeric arrangement. Furthermore, I examined the physiological relevance of the vegetative cell-specific Flv1A and Flv3A on the diazotrophic metabolism of Anabaena and demonstrated that the deletion of the vegetative cellspecific Flv3A resulted in downregulation of the heterocyst specific-protein uptake hydrogenase (Hup) which led to enhanced H2 photoproduction under both oxic and micro-oxic conditions. These results revealed a complex regulatory network between the Mehler-like reaction in the vegetative cells and the H2 metabolism in the heterocysts of Anabaena that will need to be further elucidated in future studies.

Happea tuottavaa fotosynteesiä hyödyntävien organismien kyky kehittää suojamekanismeja fotosynteettisen koneiston säätelemiseksi on ratkaisevan tärkeää, jotta eliöt selviytyisivät jatkuvasti muuttuvissa ympäristöolosuhteissa. Flavodiironiproteiinit (FDP:t) toimivat elektroninsiirtoreitissä, joka on kehittynyt kaikissa fotosynteettisissä organismeissa, lukuun ottamatta koppisiemenisiä kasveja sekä puna- ja ruskoleviä. FDP:t suojaavat eliötä liialta valoenergialta toimimalla elektroninieluina, jotka ohjaavat ylimääräisiä elektroneja fotosynteettisestä elektroninsiirtoketjusta hapelle ns. Mehlerin kaltaisen reaktion välityksellä. Väitöskirjassani selvitin syanobakteerien FDP:en säätelymekanismeja, fysiologista merkitystä ja toiminnallista säätelyä.

Yksisoluisessa syanobakteerissa Synechocystis sp. PCC 6803:ssa (tästä eteenpäin Synechocystis) Flv1/Flv3-heterodimeerin on pitkään ajateltu olevan yksin vastuussa PSI:n vastaanottajapuolella tapahtuvasta Mehlerin kaltaisesta reaktiosta sekä korkeassa (HC) että normaalissa (LC) ilman hiilidioksidipitoisuudessa. Väitöskirjassani osoitin ensimmäistä kertaa, että Flv2/Flv4-heterodimeeri vaikuttaa Mehlerin kaltaiseen reaktioon in vivo. Lisäksi vertasin Mehlerin kaltaisen reaktion kinetiikkaa HC- ja LC-olosuhteissa. Tulokseni osoittavat, että HC-olosuhteissa, joissa FDP:n merkitys on ennen ajateltu olevan pieni, villityyppisissä (WT) soluissa oleva pieni määrä Flv1/Flv3-heterodimeeriä saa aikaan merkittävän ja vakaan Mehlerin kaltaisen reaktion (kaksivaiheinen kinetiikka). Sitä vastoin LColosuhteissa (pH 6–8,2) FDP:en ilmentyminen indusoituu, ja WT-solujen hapen valopelkistys noudattaa kolmivaiheista reaktiokinetiikkaa (induktio, vaimeneminen ja vakaa tila), jonka saavat aikaan PSI:n vastaanottajapuolella sijaitsevat Flv1/Flv3 ja Flv2/Flv4. Lisäksi pystyin selvittämään Flv1/Flv3:n ja Flv2/Flv4:n vaikutuksen hapen valopelkistyksen kinetiikkaan: Flv1/Flv3 on pääasiallisesti vastuussa sen voimakkaasta, mutta ohimenevästä vaiheesta valojakson aikana LC-olosuhteissa, kun taas Flv2/Flv4 vaikuttaa enimmäkseen hitaan ja vakaan vaiheen aikana. On tärkeää huomata, että mutanttikannat, joilta puuttuu toiminnallinen NDH-1-kompleksi, eivät osoittaneet hapen valopelkistyksen vaimenemista induktion jälkeen, mikä viittaa siihen, että Flv1/Flv3:n ohimenevä aktiivisuus LC-olosuhteissa johtuu kilpailusta NDH-1-kompleksin kanssa pelkistyneeltä ferredoksiinilta tulevista elektroneista. Perusteellisempi tutkimus osoitti osittaisen toiminnallisen päällekkäisyyden Flv1/Flv3:n ja NDH-11/2:n välillä. Jatkuvassa valaistuksessa LC olosuhteissa solut, joissa ei ole NDH-11/2:ta, asettavat etusijalle PSI:n hapettumisen tehostamalla kaikkien FDP:en kertymistä ja aktiivisuutta verrattuna tehokkaaseen hiilensidonnan indusointiin. Samoissa olosuhteissa Flv1/Flv3:n ohimenevä aktiivisuuden puuttuminen voidaan korvata NDH-11/2:n ja Flv2/Flv4:n yhteistyöllä PSI:n hapettumisen ylläpitämiseksi. Sekä Flv1/Flv3:n että NDH-11/2:n samanaikainen puuttuminen johti heikentyneeseen kykyyn hapettaa PSI ja, vaikkakin resursseja uhraten, tämä mahdollisti pelkistysvoimaa tarjoavien yhdisteiden kohdistamisen hiilensidontaan. Nämä tulokset osoittivat dynaamisen koordinoinnin molempien elektroninsiirtoreittien välillä PSI:n tehokkaan hapettumisen ja hiilensidonnan varmistamiseksi. Tulokseni myös osoittavat, että Flv2/Flv4 tai NDH- 1 ei kykene korvaamaan Flv1/Flv3:a vaihtelevissa valo-olosuhteissa (FL) korostaen Flv1/Flv3:n olennaista merkitystä FL:n aikana. Lisäksi osoitin, että Flv1/Flv1- ja Flv3/Flv3- homodimeerit välittävät hapesta riippumattomia elektroninsiirtoreaktioita, jotka myötävaikuttavat Synechocystiksen sopeutumiseen FL-olosuhteisiin.

Filamenttisella, ilmakehän typpeä sitovalla syanobakteerilla Anabaena sp. PCC 7120 (tästä lähtien Anabaena) on Flv2:n ja Flv4:n lisäksi kaksi kopiota Flv1- ja Flv3 -proteiineja koodaavista geeneistä: kasvulliset solut ilmentävät Flv1A- ja Flv3Aproteiineja, kun taas Flv1B- ja Flv3B- proteiinit löytyvät kypsistä heterokysteistä. Tulokseni osoittavat, että Flv3A:lla on tärkeä rooli solujen sopeutuessa valoon riippumatta typen ja hiilidioksidin saatavuudesta. Olen myöskin osoittanut, että toisin kuin Synechocystiksen Flv3, Anabaenan Flv3A kykenee jossain määrin itsenäisesti välittämään hapen valopelkistystä Flv1A:lle. Tulokseni viittaavat siihen, että Flv3A toimii yhdessä Flv2:n ja Flv4:n kanssa muodostaen todennäköisesti erilaisia oligomeerisiä konformaatioita. Lisäksi tarkastelin vegetatiivisille soluille spesifisten Flv1A:n ja Flv3A:n fysiologista merkitystä Anabaenan typpiaineenvaihdunnassa ja osoitin, että vegetatiivisille soluille spesifisen Flv3A:n deleetio sai aikaan heterokystispesifisen uptake hydrogenase (Hup) -proteiinin ilmenemisen vähenemisen, mikä johti lisääntyneeseen vedyn tuotantoon valossa sekä ilmakehän normaalissa happipitoisuudessa että vähähappisissa olosuhteissa. Väitöskirjatyöni osoitti, että Anabaena-syanobakteerin kasvullisissa soluissa tapahtuvan Mehlerin kaltaisen reaktion ja heterokysteissä tapahtuvan vetyaineenvaihdunnan välillä toimii monimutkainen säätelyverkosto. Jatkotutkimuksissa selvitetään tämän säätelyverkoston rakennetta ja merkitystä syanobakteerin aineenvaihdunnalle.