Towards cyclopalladated therapeutic oligonucleotides

Abstract

Based on Watson—Crick base pairing principle, therapeutic oligonucleotides bear the potential to either inhibit or alter protein synthesis. Replacing or augmenting Watson—Crick base paring by metal coordination offers a promising way to increase the hybridization affinity of therapeutic oligonucleotides for target nucleic acids. Crosslinking of DNA by the anticancer agent cisplatin is a well-known example of utilization of metal—nucleic acid interactions for therapeutic purposes. Many other transition metal mediated interactions have also been widely studied but in most cases rapid ligand exchange makes applicability in the intracellular medium questionable. This thesis brings covalently palladated oligonucleotides in the light for the first time as a new addition to existing antisense techniques.

This thesis describes the synthesis of a few artificial nucleosidic and nonnucleosidic structures that offer reactive sites for cyclopalladation. The respective palladacyclic derivatives were integrated into short oligonucleotides and their base pairing preferences and effect on duplex stability studied by various techniques, including UV melting experiments (with detailed thermodynamic analysis), CD spectroscopy and Förster resonance energy transfer (FRET) –based competition assay. Pd(II) mediated base pairing in duplexes was found to depend on the structure of organometallic residue, the base pairing partner and the location of the base pair within the oligonucleotide. The palladated oligonucleotides were also tested for their splice correction ability in three human cell lines. In HeLa cells, the palladacyclic oligonucleotide modestly outperformed the corresponding unmodified oligonucleotide.

Watson—Crick –emäspariutumiseen perustuvat oligonukleotidilääkkeet kykenevät estämään tai muuttamaan proteiinisynteesiä. Watson—Crick –emäspariutumisen korvaaminen tai täydentäminen on lupaava keino lisätä oligonukleotidilääkkeiden affiniteettia kohdenukleiinihappoihin. Syöpälääke sisplatiinin aiheuttama DNA:n ristiinsilloittuminen on hyvin tunnettu esimerkki metallien ja nukleiinihappojen välisten vuorovaikutusten hyödyntämisestä lääketieteessä. Monia muitakin siirtymämetallien välittämiä vuorovaikutuksia on tutkittu mutta useimmissa tapauksissa soveltuvuus solunsisäiseen käyttöön on kyseenalaista nopean ligandinvaihdon vuoksi. Tämä väitöskirjatyö on ensimmäinen tutkimus mahdollisuudesta käyttää kovalenttisesti palladoituja oligonukleotideja antisense-sovelluksissa.

Väitöskirjassa kuvataan joidenkin sellaisten nukleosidisten ja ei-nukleosidisten rakenteiden synteesi, joissa on syklopalladaatioon sopiva reaktiivinen paikka. Vastaavat palladasykliset johdokset liitettiin osaksi lyhyitä oligonukleotideja ja niiden emäspariutumistaipumuksia sekä vaikutusta kaksoiskierteen pysyvyyteen tutkittiin CD- ja UV-sulamismittauksin (sisältäen yksityiskohtaisen termodynaamisen analyysin) sekä käyttäen Försterin resonanssienergiansiirtoon (FRET) perustuvaa kilpailukoetta. Pd(II)-välitteisen emäspariutumisen kaksoiskierteessä havaittiin riippuvan palladasyklin rakenteesta, vastinemäksestä sekä emäsparin sijainnista. Myös palladoitujen oligonukleotidien kykyä korjata virheellinen silmukoituminen testattiin kolmessa ihmisen solulinjassa. HeLa-solulinjassa palladasyklinen oligonukleotidi toimi vähän paremmin kuin vastaava modifioimaton oligonukleotidi.