Semisynthetic preparation of C‑nucleoside 5´-triphosphates as bacterial RNA polymerase substrates

Abstract

Interest in natural products as pharmaceutical leads has recently resurfaced due to increasing understanding towards the biosynthesis of natural compounds as well as advancements in methodologies that facilitate the semisynthetic preparation of novel compounds. Natural C-nucleosides are one class of bioactive compounds that have seen their biosynthetic background being elucidated in the last few years. Furthermore, the higher stability of the C-nucleosides against enzymatic and chemical hydrolysis compared to the N-nucleosides makes these compounds interesting for their potential medicinal properties.

The presented thesis focuses on semisynthesis of C-nucleoside 5´-triphosphates for studying their activity against RNA polymerases (RNAP) that are common drug targets for nucleoside-based pharmaceuticals. The natural C-nucleosides showdomycin, oxazinomycin and pseudouridimycin were produced as starting materials by cultivating strains of Streptomyces soil bacteria. Additionally, a small compound library of showdomycin analogues was prepared, by modifying the maleimide-type base moiety. The chemical 5´-phosphorylation was carried out by using the commonly used Yoshikawa-Ludwig protocol. However, the unmodified showdomycin unexpectedly isomerized during the phosphorylation affording isoshowdomycin-5´-triphosphate. In the RNAP assays, the efficiency of oxazinomycin-5´-triphosphate as a substrate was comparable to that of uridine-5´-triphosphate. In addition, in certain sequence contexts the incorporation of oxazinomycin to the RNA arrested the transcription process. On the other hand, the most promising showdomycin analogue, 4-(ethylthio)showdomycin-5´-triphosphate showed modest inhibition activity and slight selectivity towards the bacterial RNAP.

<b>C-nukleosidi-5´-trifosfaattien puolisynteettinen valmistus substraateiksi bakteriaaliselle RNA polymeraasille</b>

Mielenkiinto luonnonyhdisteiden käyttöä kohtaan lääkekehityksen johtoyhdisteinä on viime aikoina kohonnut uudelleen. Tähän ovat osaltaan vaikuttaneet lisääntynyt ymmärrys luonnonyhdisteiden biosynteesiä kohtaan sekä kehittyneet menetelmät, jotka helpottavat uusien yhdisteiden puolisynteettistä valmistusta. Luonnolliset Cnukleosidit ovat yksi bioaktiivinen yhdisteryhmä, jonka biosynteettinen alkuperä on selventynyt viimeisimpien vuosien aikana. Lisäksi C-nukleosidien suurempi pysyvyys entsymaattista ja kemiallista hydrolyysiä kohtaan verrattuna Nnukleosideihin tekee näistä yhdisteistä mielenkiintoisia mahdollisten lääkinnällisten ominaisuuksiensa vuoksi.

Tämä väistöskirjatyö keskittyy C-nukleosidien 5´-trifosfaattien puolisynteesiin niiden aktiivisuuden tutkimiseksi RNA polymeraasien (RNAP) kanssa, jotka ovat yleinen nukleosidipohjaisten lääkeaineiden vaikutuskohde. Lähtöaineiksi tuotettiin luonnollisiin C-nukleosideihin kuuluvat showdomysiini, oksatsinomysiini ja pseudouridimysiini viljelemällä Streptomyces-suvun maaperäbakteereja. Lisäksi valmistettiin pieni, showdomysiini-johdannaisista koostuva yhdistekirjasto modifioimalla sen maleimidi-tyyppistä emäsosaa. Valmistetut C-nukleosidit fosforyloitiin kemiallisesti käyttäen yleisestä Yoshikawa-Ludwig -menetelmää. Muokkaamaton showdomysiini kuitenkin isomeroitui odottamattomasti fosforylaation aikana antaen tuotteeksi iso-showdomysiini-5´-trifosfaatin. RNAP–kokeissa oksatsinomysiini-5´- trifosfaatin kyky toimia substraattina oli verrattavissa uridiini-5´-trifosfaattiin. Lisäksi oksatsinomysiinin liittyminen RNA:han tietyissä emäsjärjestyskonteksteissa keskeytti transkription. Sen sijaan showdomysiinijohdannaisista lupaavin, 4- (etyylitio)showdomysiini osoitti kohtalaista inhibitioaktiivisuutta ja lievää selektiivisyyttä bakteeriperäistä RNA polymeraasia kohtaan.