Pathogenesis of LMNA-related dilated cardiomyopathy

Abstract

Dilated cardiomyopathy (DCM) is a progressive myocardial disease that leads to dilatation of cardiac ventricles, reduced contractile force, and a high risk of sudden cardiac death. The second most common gene mutated in the familial form of DCM is LMNA, and the founder mutation p.S143P is the most frequently reported mutation among Finnish DCM patients. LMNA gene encodes nuclear proteins lamin A/C that constitute the nuclear lamina and regulate several cellular functions, e.g., nuclear stability and gene expression. However, the mechanisms of how lamin mutations cause DCM are poorly understood, and there are no effective treatments available.

The aim of this thesis project was to study how the p.S143P LMNA mutation affects cell function and viability and how these alterations contribute to DCM development. Using primary patient fibroblasts and transfection models, we showed that the p.S143P mutant lamin A/C is more nucleoplasmic, soluble, and dynamic compared to wild-type (WT) lamin A/C. Furthermore, in vitro assembly experiments showed that the p.S143P lamin A is not able to form typical filaments but forms disorganized aggregates. The consequences of the p.S143P mutation on induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) were investigated in the second substudy, where mutant cells showed similar nucleoplasmic lamin A/C distribution. CMs were challenged with ischemic stress, which caused significant sarcomere damage and apoptosis in mutant CMs. In the third substudy, we analyzed the function of lamin A/C under heat shock (HS). We demonstrated that lamin A/C are hyperphosphorylated under HS in control and patient cells. However, the patient cells were more sensitive to heat stress than control cells, affecting cell survival during HS recovery. In the fourth substudy, we determined the mechanical stress response of the patient cells. Unlike the control cells, the mutant cells showed nuclear rupture, cytoskeletal damage, and cellular disarray under mechanical strain.

To conclude, these results show that the p.S143P mutation changes the intrinsic properties of lamin A/C affecting its incorporation into the lamina and mislocalization to the nucleoplasm. Mislocalization of lamins deteriorates the lamina structure, leading to nuclear rupture and cytoskeletal damage under stress. These alterations inevitably contribute to the development of DCM.

<b>LMNA-geenimutaatioiden aiheuttaman laajentavan kardiomyopatian syntymekanismit</b>

Laajentava kardiomyopatia (DCM) on etenevä sydänlihassairaus, jolle on ominaista sydämen kammioiden laajeneminen, sydämen vajaatoiminta sekä lisääntynyt äkkikuoleman riski. LMNA-geenimutaatiot ovat yksi perinnöllisen DCM:n aiheuttaja ja suomalaisilla DCM potilailla p.S143P on yleisin tunnistettu LMNA-geenimutaatio. Lamiinit muodostavat tumakalvon sisäpinnalle säieverkoston (lamina), joka tukee tuman muotoa sekä säätelee geenien ilmentymistä. LMNA-geenin aiheuttaman DCM:n syntymekanismit ovat edelleen huonosti ymmärrettyjä eikä tautiin ole saatavilla tehokasta hoitomuotoa.

Tämän väitöskirjatutkimuksen tavoitteena oli selvittää, miten p.S143P LMNAmutaatio vaikuttaa solujen toimintaan ja elinkelpoisuuteen sekä miten nämä muutokset vaikuttavat DCM syntyyn. Ensimmäisessä osatyössä analysoimme DCM potilailta eristettyjä fibroblasteja sekä transfektoituja soluja ja havaitsimme p.S143P mutaation estävän lamiini A:ta muodostamasta välikokoisia säikeitä, mikä johti proteiinin poikkeavaan sijoittumiseen tuman sisäosaan ja osassa soluista lamiinien aggregoitumiseen. Toisessa osatyössä tutkimme p.S143P mutaation vaikutuksia potilaiden fibroblasteista kantasolutekniikalla erilaistetuissa sydänsoluissa. Mutaatiota kantavissa sydänsoluissa lamiini A oli vastaavasti sijoittunut enemmän tuman sisäosaan. Iskeemisen stressin aikana, mutanteilla sydänsoluilla havaittiin selvästi enemmän sarkomeerirakenteen vaurioita sekä solukuolemia. Kolmannessa osatyössä tutkimme lamiini A/C:n vastetta lämpösokkiin. Havaitsimme, että lamiini A/C fosforyloituu lämpösokin aikana sekä potilas- että verrokki soluissa. Potilassolut osoittautuivat kuitenkin herkemmäksi lämpösokille kuin verrokkisolut, mikä heikensi potilassolujen elinkelpoisuutta lämpösokin jälkeen. Neljännessä osatyössä tutkimme potilassolujen vastetta mekaaniseen rasitukseen, mikä aiheutti potilassoluille tuman hajoamisen sekä tukirakenteen vaurioita.

Tutkimustulosten perusteella voidaan päätellä, että p.S143P mutaatio estää lamin A/C:ta muodostamasta normaaleita välikokoisia säikeitä, mikä johtaa proteiinin poikkeavaan sijaintiin tumassa. Lamiini A/C sijoittuminen tuman sisäosiin heikentää laminan rakennetta ja aiheuttaa tuman hajoamisen sekä tukirangan vaurioita stressin aikana. Nämä tekijät vaikuttavat yhdessä DCM:n kehittymiseen.