Phage display based approach for identifying novel HDL particle binders: Recombinant HDL antibodies as novel diagnostic tool for risk assessment and monitoring of coronary artery disease

Abstract

Cholesterol content of high density lipoprotein (HDL-C) has been a well established cardiac risk marker for coronary artery disease (CAD), a major cause of mortality worldwide. Various epidemiological and experimental animal studies have shown the inverse correlation between concentration of HDL-C and CAD. However, recent pharmacological studies and genetic studies have demonstrated lack of protection from CAD despite of elevated HDL-C. HDLs are a heterogenous group of particles with varying protein/lipid composition and anti-atherogenic (atheroprotective) function. Atheroprotective HDL particles could turn dysfunctional and thereby attenuate their atheroprotective properties under particular circumstances such as among subjects with metabolic syndrome. Therefore, it is hypothesised that risk assessment and clinical management of atherosclerotic CAD (ATCAD) should target these dysfunctional HDL particles rather than focusing on HDL-C.

The aim of this thesis was to develop antibodies against HDL particles by using phage display based antibody library and implement them for development of immunoassay for diagnosis of CAD and its risk estimation in symptomatic and asymptomatic individuals. To that end in publication I, a large set of HDL antibodies were isolated against the HDL derived from CAD patients. These antibodies were characterized against different HDL preparations, most abundant proteins of HDL (i.e. apoA-I and apoA-II) and plasma. A variety of binders were identified. In publication II, three distinct pairs of HDL antibodies which were mainly recognizing the apoA-I were employed to develop three different phage based two-site apoA-I immunoassays identified as assay 022-454, assay 109-121 and assay 110-525. Assays 109-121 and 110-525 showed promise to further improve the diagnostic and predictive value for cardiac conditions. In publication III, simplified versions of two of the phage based two-site immunoassays (109-121 and 110-525) is presented and clinically assessed with a cohort of cardiac patients. Higher level of apoA-I measured with the assay 110-525 showed clear association with ATCAD especially in patients not using lipid lowering medication. In light of these observations, it can be said that that a large number of antibodies were obtained against the intact HDL molecules with phage display approach. The results from testing clinical specimens with the new combinations of HDL binders suggest a different and improved performance over existing test technologies in estimating risk of ATCAD However, further evaluation of these HDL binders with larger cohorts is clearly warranted. In addition, these antibodies could also serve as analytical tools for unravelling the etiology and the pathological process of atherosclerosis in relation to HDL.

<b>Uudenlaisten HDL-partikkelia tunnistavien sitojien kehittäminen faaginäyttötekniikan avulla: rekombinanttiset HDL-vasta-aineet uudenlaisina diagnostisina työkaluina sepelvaltimotaudin riskinarvioinnissa ja seurannassa</b>

Sepelvaltimotauti on merkittävä kuolinsyy maailmalaajuisesti. Suuritiheyksisen lipoproteiinin kolesterolipitoisuus (high density lipoprotein cholesterol, HDL-C) on laajalti tunnustettu sepelvaltimotaudin riskitekijä. Monet epidemiologiset sekä kokeelliset eläintutkimukset ovat osoittaneet, että HDL-C on käänteisesti yhteydessä sepelvaltimotautiin. Viimeaikaisissa farmakologisissa ja geneettisissä tutkimuksissa ei ole kuitenkaan pystytty osoittamaan, että koholla oleva HDL-C suojelisi sepelvaltimotaudilta. HDL-partikkelit ovat heterogeeninen ryhmä partikkeleja, joiden proteiini- ja lipidikoostumus sekä ateroskleroosilta suojelevat ominaisuudet vaihtelevat. Tietyissä yhteyksissä, kuten esimerkiksi metabolista oireyhtymää sairastavilla, ateroskleroosilta suojaavat HDL-partikkelit voivat muuntua toiminnaltaan, jolloin niiden ateroskleroosilta suojaavat ominaisuudet voivat heikentyä. Tästä syystä on esitetty, että ateroskleroosiin liittyvän sepelvaltimotaudin riskinarvio ja hoito pitäisi perustua toiminnaltaan heikentyneisiin HDL-partikkeleihin HDL-C:n sijaan.

Tämän väitöskirjan tavoitteena oli löytää vasta-aineita HDL-partikkeleille faaginäyttötekniikkaan perustuvalla vasta-ainekirjastolla sekä kehittää niitä käyttäen immunomäärityksiä sepelvaltimotaudin diagnostiikkaan ja riskinarviointiin. Näiden tavoitteiden puitteissa julkaisussa I eristettiin suuri ryhmä HDL-vasta-aineita käyttämällä kohteena sepelvaltimotautipotilaiden HDL-partikkeleita. Vasta-aineet karakterisoitiin käyttämällä hyväksi erilaisia HDL-valmisteita, HDL-partikkelien yleisimpiä proteiineja (apoA-I ja apoA-II) ja plasmaa. Eristettyjen vasta-aineiden joukosta tunnistettiin erilaisia vasta-aineita. Julkaisussa II kehitettiin kolme apoA-I-proteiinia tunnistavaa kaksipuolista immunomääritystä (määritys 022-454, määritys 109-121 ja määritys 110-525), joissa hyödynnettiin kolmea keskenään erilaista, pääosin apoA-I -proteiinia tunnistavaa vastaaineparia. Määritykset 109-121 ja 110-525 näyttivät lupaavilta sen suhteen, että ne voisivat pystyä parantamaan sydänsairauksia diagnostiikkaa ja ennustettavuutta. Käsikirjoituksessa III esitetään yksinkertaistetut versiot kahdesta faagipohjaisesta kaksipuolisesta immunomäärityksestä (109-122 ja 110-525) ja arvioidaan niiden kliininen toiminta sydänpotilasryhmän kanssa. Määrityksellä 110-525 mitattu korkeampi apoA-I pitoisuus oli selvästi yhteydessä ateroskleroosiin liittyvään sepelvaltimotautiin erityisesti niillä potilailla, joilla ei ollut lipidejä laskevaa lääkitystä. Näiden havaintojen valossa voidaan todeta, että tutkimuksessa löydettiin faaginäyttötekniikalla useita HDL-molekyylejä tunnistavia vastaaineita. Kliinisillä näytteillä saatujen tulosten perusteella näiden uusien sitojien kombinaatiot näyttävät ennustavan ateroskleroosiin liittyvää sepelvaltimotautia eri tavalla ja paremmin kuin nykyään käytössä olevat testimenetelmät. Tulokset pitää kuitenkin vahvistaa laajemmilla potilasjoukoilla. Tutkimuksessa löydetyt vasta-aineet voisivat lisäksi olla hyödyllisiä analyyttisinä työkaluina tutkittaessa ateroskleroosin etiologiaa ja patologisia prosesseja suhteessa HDL-partikkeleihin.