Genomic editing to elucidate the effects of PIM kinases on cancer cell signalling

Abstract

In humans, there are three PIM family genes, the two first of which were originally identified from mice as proviral integration sites for Moloney leukemia virus. They encode serine/threonine kinases that are aberrantly expressed in a variety of hematological malignancies and solid tumors. PIM kinases contribute to cell proliferation, cell survival and cell motility by phosphorylating multiple downstream substrates. PIM kinases have emerged as attractive anti-cancer drug targets, and their distinct structures enable the generation of selective inhibitors.

The aim of this PhD study was to functionally validate three novel PIM targets that affect cancer cell signalling, namely actin capping proteins (CPs) that restrict elongation of actin fibers, liver kinase B1 (LKB1) that suppresses cell growth, and lactate dehydrogenase A (LDHA) that regulates cell metabolism. For this purpose, CRISPR/Cas9-based genome editing and structurally unrelated pharmacological PIM-selective inhibitors were used. PIM-targeted sites were identified by mass spectrometry and mutagenesis, after which the functional impacts of phosphorylation were studied in cultured cells or using a chick embryo xenograft model. In line with the pro-migratory function of PIM kinases, phosphorylation of CPs was shown to reduce their ability to bind to the plus ends of actin filaments and thereby to promote cell adhesion and migration. Catalytic activity of LKB1 towards its substrates such as AMPK was shown to be inhibited by PIM-dependent phosphorylation. These studies also indicated that the oncogenic effects of PIMs and the tumor-suppressive effects of LKB1 are tightly controlled at the cellular level. In the case of LDHA, PIM-dependent phosphorylation was observed to prevent nuclear LDHA from being degraded via K48-mediated ubiquitination, highlighting the connection between PIM kinases and the regulation of glycolytic enzymes. Altogether, the results from these studies help to better understand the mechanisms, through which PIM kinases stimulate cancer cell signalling.

<b>Genomin muokkaus PIM-kinaasien vaikutusten tutkimiseksi syöpäsoluissa</b>

Ihmisen PIM-geeniperheen kolmesta jäsenestä kaksi ensimmäistä löydettiin alun perin hiiristä Moloney-leukemiaviruksen integraatiokohtina. Niiden koodaamat seriini/treoniinikinaasit ilmentyvät poikkeavasti erilaisissa hematologisissa sekä kiinteissä kasvaimissa. PIM-kinaasit edistävät solujen lisääntymistä, eloonjäämistä sekä liikkuvuutta fosforyloimalla useita kohdeproteiinejaan. Kiinnostus PIMkinaasien toimintaa estäviä syöpälääkkeitä kohtaan on viime aikoina lisääntynyt, ja niiden poikkeava rakenne mahdollistaa valikoivien estolääkkeiden kehittämisen.

Tämän väitöstutkimuksen tavoitteena oli toiminnallisesti tutkia kolmea uutta syöpäsolujen viestintään vaikuttavaa PIM-kohdeproteiinia: aktiinisäikeiden pitenemistä rajoittavia CP-proteiineja, solujen kasvua rajoittavaa LKB1-kinaasia ja aineenvaihduntaa säätelevää laktaattidehydrogenaasia A (LDHA). Tutkimuksissa käytettiin CRISPR/Cas9-pohjaista genominmuokkausta sekä rakenteellisesti erilaisia PIM-selektiivisiä estolääkkeitä. PIM-kinaasien fosforyloimat kohdat paikannettiin massaspektrometrian ja mutageneesin avulla, ja fosforylaation merkitystä tutkittiin soluviljelmissä tai kananmunan alkion siirrännäismallin avulla. CP-proteiinien fosforylaation osoitettiin vähentävän niiden kykyä sitoutua aktiinisäikeiden plus-päihin, ja siten edistävän solujen adheesiota ja migraatiota, selittäen PIM-kinaasien kykyä lisätä solujen liikkuvuutta. PIM-fosforylaatio heikensi LKB1:n katalyyttistä aktiivisuutta ja siten esti sitä fosforyloimasta omia kohdeproteiinejaan, kuten AMPK-kinaasia. Nämä tutkimukset myös osoittivat, että PIMkinaasien onkogeenisia ja LKB1:n vastakkaisia vaikutuksia säädellään ristiin solutasolla. LDHA:n tapauksessa fosforylaation havaittiin estävän LDHA-proteiinin hajoamista tumassa K48-välitteisen ubikitinaation kautta, korostaen PIM-kinaasien ja glykolyyttisten entsyymien säätelyn välistä yhteyttä. Kaiken kaikkiaan näiden tutkimusten tulokset auttavat paremmin ymmärtämään niitä mekanismeja, joilla PIM-kinaasit stimuloivat syöpäsolujen viestintää.