siRNA-pallonukleiinihappojen synteesi ja karakterisointi
Laasonen, Aino (2023-04-25)
siRNA-pallonukleiinihappojen synteesi ja karakterisointi
(25.04.2023)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
avoin
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2023050240173
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2023050240173
Tiivistelmä
Iän myötä tapahtuva silmänpohjan rappeutuminen on yksi merkittävä sokeutumiseen johtava tekijä. Silmärappeumataudin patogeneesi on tuntematon, mutta sen taustalla tiedetään olevan silmän RPE retinal pigment epithelium) -solujen ilmentämät pro-inflammatoriset geenit. Itä-Suomen yliopistossa on tutkittu GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) -geeniä hiljentävää siRNA:ta (small interfering RNA). RPE-solumallilla tehdyistä solukokeista on saatu lupaavia tuloksia, mutta paljaat siRNA-juosteet kulkeutuivat soluihin heikosti. siRNA-juosteiden pakkaaminen pallonukleiinihapon muotoon lisää niiden solukuljetusta ja pysyvyyttä. Tämän työn tarkoitus on syntetisoida ja karakterisoida erilaisia GAPDH-siRNA:n sisältäviä pallonukleiinihappoja ja niiden kolesterolikonjugaatteja sekä selvittää, miten erilaiset pallorakenteet vaikuttavat siRNA:n ominaisuuksiin.
Tässä työssä valmistettiin kolme erilaista pallonukleiinihappoa käyttäen keskusrakenteina atisidimodifioitua [C60]-fullereenia ja polyoktaedrista silseskvioksaania (POSS). Pallonukleiinihappojen valmistusta varten aminomodifioituun leimattomaan ja leimattuun sense-juosteeseen konjugoitiin bisyklononyyni (BCN) sekä antisense-juosteeseen kolesteroli. Sense-juosteet liitetiin keskusrakenteisiin rengasjännityksen tehostamalla alkyyni–atsidi-sykloadditiolla (SPAAC). Pallonukleiinihappoja hybridisoitiin antisense-juosteen ja sen kolesterolikonjugaatin seoksilla. Valmiit pallonukleiinihapot karakterisoitiin PAGE:lla (poly acryl amide gel electrophoresis), SEC-MALS:illa (Size-exclusion chormatography–multiple angle light scattering), sulamislämpötilamittauksin ja DLS:llä (dynamic light scattering). Lisäksi valmistettuja pallonukleiinihappoja lähetettiin Itä-Suomen yliopistoon RPE-solumallissa tutkittaviksi.
Kaikki halutut pallonukleiinihapot onnistuttiin valmistamaan ja käytetyt menetelmät soveltuivat hyvin sekä pallonukleiinihappojen synteesiin että niiden karakterisointiin. Tehdyt solukokeet osoittivat [C60]-fullereenipallonukleiinihappojen hiljentävän GAPDH-geenin ilmennystä huomattavasti paljasta siRNA:ta paremmin. Fluoreskeiinileimaus ja kolesterolikonjugaatio eivät häirinneet geenin hiljennystä. POSS-ydin näyttäisi olevan [C60]-fullereeniydintä parempi keskusrakenne. POSS-pallonukleiinihapon synteesi onnistui yhtä hyvin, ellei paremminkin, kuin [C60]-fullereenipallonukleiinihapolla. Lisäksi saatu tuote oli homogeenisempi.
Pallonukleiinihapot ovat hyvä solukuljetin silmänpohjan ikärappeumaan kohdennetulle GAPDH-siRNA:lle. Lisäksi biohajoava ja bioyhteensopiva POSS-keskusrakenne voisi olla [C60]-fullereenin ekologisesti kestävämpi korvaaja. Tulevaisuudessa pallonukleiinihappoja voitaisiin pakata solunulkoisiin vesikkeleihin solukuljetuksen parantamiseksi edelleen.
Tässä työssä valmistettiin kolme erilaista pallonukleiinihappoa käyttäen keskusrakenteina atisidimodifioitua [C60]-fullereenia ja polyoktaedrista silseskvioksaania (POSS). Pallonukleiinihappojen valmistusta varten aminomodifioituun leimattomaan ja leimattuun sense-juosteeseen konjugoitiin bisyklononyyni (BCN) sekä antisense-juosteeseen kolesteroli. Sense-juosteet liitetiin keskusrakenteisiin rengasjännityksen tehostamalla alkyyni–atsidi-sykloadditiolla (SPAAC). Pallonukleiinihappoja hybridisoitiin antisense-juosteen ja sen kolesterolikonjugaatin seoksilla. Valmiit pallonukleiinihapot karakterisoitiin PAGE:lla (poly acryl amide gel electrophoresis), SEC-MALS:illa (Size-exclusion chormatography–multiple angle light scattering), sulamislämpötilamittauksin ja DLS:llä (dynamic light scattering). Lisäksi valmistettuja pallonukleiinihappoja lähetettiin Itä-Suomen yliopistoon RPE-solumallissa tutkittaviksi.
Kaikki halutut pallonukleiinihapot onnistuttiin valmistamaan ja käytetyt menetelmät soveltuivat hyvin sekä pallonukleiinihappojen synteesiin että niiden karakterisointiin. Tehdyt solukokeet osoittivat [C60]-fullereenipallonukleiinihappojen hiljentävän GAPDH-geenin ilmennystä huomattavasti paljasta siRNA:ta paremmin. Fluoreskeiinileimaus ja kolesterolikonjugaatio eivät häirinneet geenin hiljennystä. POSS-ydin näyttäisi olevan [C60]-fullereeniydintä parempi keskusrakenne. POSS-pallonukleiinihapon synteesi onnistui yhtä hyvin, ellei paremminkin, kuin [C60]-fullereenipallonukleiinihapolla. Lisäksi saatu tuote oli homogeenisempi.
Pallonukleiinihapot ovat hyvä solukuljetin silmänpohjan ikärappeumaan kohdennetulle GAPDH-siRNA:lle. Lisäksi biohajoava ja bioyhteensopiva POSS-keskusrakenne voisi olla [C60]-fullereenin ekologisesti kestävämpi korvaaja. Tulevaisuudessa pallonukleiinihappoja voitaisiin pakata solunulkoisiin vesikkeleihin solukuljetuksen parantamiseksi edelleen.