Tools and strategies for RNA-sequencing data analysis

Abstract

RNA-Sequencing (RNA-seq) has enabled the in-depth study of the transcriptome, becoming the primary research method in the field of molecular biology. The typical aim of RNA-seq is to quantify and detect differentially expressed (DE) and differentially spliced (DS) genes. Numerous methodologies and tools have been developed in recent years to assist in analyzing RNA-seq data. However, it is difficult for researchers to decide which methods or strategies they should adopt to optimize the analysis of their datasets.

In this Thesis, in Study I, we applied the gene-level DE analysis approach to detect the androgen-regulated genes between cancerous and benign samples in 48 primary prostate cancer patients. Combined with other measurements from the same samples, our analysis indicated that patients having TMPRSS-ERG gene fusion had distinct intratumoral androgen profiles compared to TMPRSS-ERG negative tumors. However, the DE can remain undetected when the expression varies across the gene due to reasons such as alternative splicing. Hence, to account for this problem, an alternate analysis approach has been suggested in which the statistical testing of lower feature levels (e.g. transcripts, transcript compatibility counts, or exons) is performed initially, followed by aggregating the results to the gene level. In Study II, we tested this alternate approach on these lower features and compared the results to those from the conventional gene-level approach. In the alternate approach, two methods (Lancaster method and empirical brown method (ebm)) were tested for aggregating the feature-level results to gene-level results. Our results suggest that the exon-level estimates improve the detection of the DE genes when the ebm method is used for aggregating the results. Accordingly, R/Bioconductor package EBSEA was developed using the winning approach.

RNA-seq data can also be used to find DS events between conditions. However, the detection of DS is more challenging than the detection of DE. In Study III, a comprehensive comparison of ten DS tools was performed. We concluded that exonbased and event-based methods (rMATS and MAJIQ) performed overall best across the different evaluation metrics considered. Furthermore, we observed overall low concordance between the results reported by the different tools, making it recommendable to use more than one tool when performing DS analysis, and to concentrate on the overlapping results.

Työkaluja ja strategioita RNA-sekvensointidatan analyysiin

RNA-sekvensointi (RNA-seq) on mahdollistanut transkriptomin yksityiskohtaisen tarkastelun ja siitä on tullut hyvin suosittu työkalu molekyylibiologian tutkimuksessa. RNA-sekvensointitutkimusten tyypillinen tarkoitus on selvittää näyteryh- mien välillä eriävästi ilmentyviä ja silmukoituvia geenejä. RNA-sekvensointidatojen analyysiin on kehitetty runsaasti työkaluja ja usein on haastavaa valita näiden joukosta optimaaliset välineet tietyn aineiston käsittelyyn.

Tässä väitöstyössä osajulkaisussa I tunnistettiin androgeenihormonien säätelemiä eriävästi ilmentyviä geenejä syöpäkudoksen ja terveen kudoksen välillä 48 eturauhassyöpäpotilaalla. Kun nämä tulokset yhdistettiin muihin samojen potilaiden käytettävissä oleviin mittausarvoihin, havaittiin, että TMPRSS-ERG-geenifuusion omaavien potilaiden syöpäkudoksen androgeenihormonigeenien ilmentymisprofiili poikkesi verrattuna niihin potilaisiin, joilta ei löytynyt vastaavaa geenifuusiota. On kuitenkin mahdollista, että tällä lähestymistavalla eriävä ilmentyminen jää joidenkin geenien osalta havaitsematta, jos ilmentymistaso vaihtelee geenin eri osissa, esimerkiksi vaihtoehtoisen silmukoinnin vaikutuksen vuoksi. Ratkaisuksi tähän on esitetty uudenlaista lähestymistapaa, jossa tilastollinen testaus näyteryhmien välillä suoritetaan geenin rakenteen osalta hienojakoisemmalla tasolla (esimerkiksi transkriptien, transkriptiyhteensopivien mittausyksiköiden tai eksonien tasolla) ja vasta näin saadut osatulokset yhdistetään geenitason kokonaistulokseksi. Julkaisussa II verrattiin tätä lähestymistapaa perinteiseen geenitason analyysiin testaamalla kahta eri menetelmää tulosten yhdistämiseen takaisin geenitasolle: 1) Lancaster- menetelmää ja 2) empiiristä Brown-menetelmää (ebm). Tulosten perusteella eksonitason mittausarvojen käyttö yhdistettynä ebm-menetelmään paransi eriävästi ilmentyvien geenien tunnistusta. Tämä lähestymistapa on sisällytetty väitöstyössä kehitettyyn geenien eriävää ilmentymistä analysoivaan R/Bioconductor -analyysipakettiin EBSEA.

RNA-sekvensointidataa voidaan käyttää myös eriävien silmukointitapahtumien tunnistamiseen näyteryhmien välillä. Tämä on kuitenkin haastavampaa kuin geenien eriävän ilmentymisen analyysi. Julkaisussa III vertailtiin kymmentä eriävien silmukointitapahtumien tunnistamiseen kehitettyä työkalua. Näistä työkaluista eksoniperustaiset ja silmukointitapahtumaperustaiset työkalut (erityisesti rMATS ja MAJIQ) tuottivat parhaat kokonaistulokset käytetyillä vertailukriteereillä. Työkalujen tuottamien tulosten välillä havaittiin kuitenkin merkittäviä eroja, minkä johdosta tulosten jatkotarkastelussa on hyödyllistä keskittyä niihin tuloksiin, jotka ovat löydettävissä useammalla kuin yhdellä työkalulla.