Molecular Insights on Pertussis Toxin: Structure, Function, and Inhibition
Sakari, Moona (2024-05-24)
Molecular Insights on Pertussis Toxin: Structure, Function, and Inhibition
(24.05.2024)
Turun yliopisto
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:ISBN:978-951-29-9689-6
https://urn.fi/URN:ISBN:978-951-29-9689-6
Tiivistelmä
ABSTRACT
The rise of antibiotic-resistant pathogenic bacteria and the increasing understanding of the beneficial role of the bacterial microbiota, disrupted by antibiotics, prompt the development of new anti-bacterial therapies. One such approach targets bacterial virulence factors such as exotoxins, which are often the disease-causing virulence factor, making them appealing drug development targets. Detailed molecular understanding of exotoxins is crucial for efficient drug development efforts.
This study focuses on pertussis toxin (PT), a major virulence factor of Bordetella pertussis, the causative agent of whooping cough. PT, an ADP-ribosyltransferase (ART) toxin, disrupts cellular signaling by transferring ADP-ribose from nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to inhibitory α-subunits of G proteins of the host cell, leading to variety of systemic pathologies. The aim of the study was to identify small molecules inhibiting the ART activity of PT, and to obtain atomic resolution structural insights of the binding poses of the inhibitors as well as of the ART activity of PT.
An in vitro high-throughput multiwell assay to screen small molecules inhibiting the ART activity of PT was developed. Two compounds, effective at low micromolar levels in vitro, with one also potent in living cells, were identified. No binding poses for the compounds were obtained with X-ray crystallography. However, crystal structures of PT in complex with NAD+, its hydrolysis products ADP-ribose and nicotinamide, NAD+ analog PJ34 (ART inhibitor), and a novel NAD+ analog formed upon crystallization with 3-aminobenzamide (ART inhibitor) and NAD+, were obtained. These structures provide novel insights into pre- and post-NAD+ hydrolysis steps of the ART activity of PT and provide a rational basis to develop ART inhibitors as well as the biocatalytic use of PT to produce the novel NAD+ analog for biochemical and structural experiments with NAD+ binding proteins.
In conclusion, this study identified small molecules inhibiting the ART activity of PT and obtained atomic resolution structural insights of the ART activity, as well as binding poses of the small molecules in PT, known to inhibit other ARTs. These findings could aid in the rational drug design approaches and development of PT-specific small-molecule inhibitors.
KEYWORDS:whooping cough, pertussis toxin, ADP-ribosyltransferase, inhibitor, drug development TIIVISTELMÄ
Antibioottiresistentit bakteerit sekä ymmärrys antibioottien haitallisesta vaikutuksesta suotuisaan mikrobistoon korostavat tarvetta kehittää vaihtoehtoisia hoitomuotoja bakteeritaudeille. Yksi keino on bakteerien virulenssitekijöiden, kuten eksotoksiinien, kohdentaminen. Eksotoksiineilla on usein keskeinen osuus taudin aiheuttamisessa, mikä tekee niistä hyviä lääkekehityskohteita. Eksotoksiinien yksityiskohtainen ymmärtäminen on tärkeää uusien hoitomuotojen kehittämisessä.
Tämä tutkimus keskittyy pertussistoksiiniin (PT), joka on hinkuyskää aiheuttavan Bordetella pertussis -bakteerin tärkeä virulenssitekijä. PT on ADP-ribosyyli-transferaasi (ART), joka häiritsee soluviestintää siirtämällä ADP-riboosin nikotiiniadeniinidinukleotidilta (NAD+) isäntäsolun G-proteiinin inhibitoriseen α-alayksikköön, johtaen moniin systeemisiin häiriöihin. Tavoitteena oli löytää pienmolekyylisiä yhdisteitä, jotka estävät PT:n ART-toimintaa, ja tutkia atomitasolla PT:n rakennetta yhdisteiden sitoutumisen sekä ART-toiminnan kannalta.
Tässä työssä kehitettiin erittäin tehokas PT:n toimintaa estävien pienmolekyylisten yhdisteiden in vitro -seulontamenetelmä, jolla löydettiin kaksi PT:n aktiivisuutta estävää pienmolekyylistä yhdistettä. Ne osoittautuivat tehokkaiksi matalina pitoisuuksina in vitro, ja toinen on tehokas myös elävissä soluissa. Näille yhdisteille ei saatu kiderakennetta, mutta rakenteet saatiin PT:lle yhdessä NAD+, sen hydrolyysituotteiden ADP-riboosin ja nikotiininamidin, NAD+ analogi PJ34:n (ART-inhibiittori) sekä uuden NAD+ analogin kanssa, joka muodostui kiteytettäessä 3-aminobentsamidia (ART-inhibiittori) ja NAD+:ia. Nämä rakenteet antavat uutta tietoa PT:n ART-toiminnasta NAD+-hydrolyysin eri vaiheissa ja luovat pohjaa PT:n ART-toimintaa estävien yhdisteiden rationaaliselle lääkesuunnittelulle sekä PT:n käytölle biokatalyyttisena alustana uuden NAD+ analogin tuottamiseen biokemiallisiin ja rakenteellisiin kokeisiin NAD+:ia sitovien proteiinien kanssa.
Yhteenvetona tämä väitöstyö löysi pienmolekyylisiä yhdisteitä, jotka estävät PT:n toimintaa ja tarjoaa atomitason rakenteellista tietoa PT:n ART-toiminnasta sekä sitoutumisesta tunnettujen ART-entsyymejä inhiboivien pienmolekyylisten yhdisteiden kanssa. Tämä tieto voi auttaa sekä rationaalisen lääkesuunnittelun menetelmien että PT:lle suunnattuja pienimolekyylisten yhdisteiden kehittämisessä.
AVAINSANAT: hinkuyskä, pertussistoksiini, ADP-ribosyylitransferaasi, inhibiittori, lääkehehitys
The rise of antibiotic-resistant pathogenic bacteria and the increasing understanding of the beneficial role of the bacterial microbiota, disrupted by antibiotics, prompt the development of new anti-bacterial therapies. One such approach targets bacterial virulence factors such as exotoxins, which are often the disease-causing virulence factor, making them appealing drug development targets. Detailed molecular understanding of exotoxins is crucial for efficient drug development efforts.
This study focuses on pertussis toxin (PT), a major virulence factor of Bordetella pertussis, the causative agent of whooping cough. PT, an ADP-ribosyltransferase (ART) toxin, disrupts cellular signaling by transferring ADP-ribose from nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) to inhibitory α-subunits of G proteins of the host cell, leading to variety of systemic pathologies. The aim of the study was to identify small molecules inhibiting the ART activity of PT, and to obtain atomic resolution structural insights of the binding poses of the inhibitors as well as of the ART activity of PT.
An in vitro high-throughput multiwell assay to screen small molecules inhibiting the ART activity of PT was developed. Two compounds, effective at low micromolar levels in vitro, with one also potent in living cells, were identified. No binding poses for the compounds were obtained with X-ray crystallography. However, crystal structures of PT in complex with NAD+, its hydrolysis products ADP-ribose and nicotinamide, NAD+ analog PJ34 (ART inhibitor), and a novel NAD+ analog formed upon crystallization with 3-aminobenzamide (ART inhibitor) and NAD+, were obtained. These structures provide novel insights into pre- and post-NAD+ hydrolysis steps of the ART activity of PT and provide a rational basis to develop ART inhibitors as well as the biocatalytic use of PT to produce the novel NAD+ analog for biochemical and structural experiments with NAD+ binding proteins.
In conclusion, this study identified small molecules inhibiting the ART activity of PT and obtained atomic resolution structural insights of the ART activity, as well as binding poses of the small molecules in PT, known to inhibit other ARTs. These findings could aid in the rational drug design approaches and development of PT-specific small-molecule inhibitors.
KEYWORDS:whooping cough, pertussis toxin, ADP-ribosyltransferase, inhibitor, drug development
Antibioottiresistentit bakteerit sekä ymmärrys antibioottien haitallisesta vaikutuksesta suotuisaan mikrobistoon korostavat tarvetta kehittää vaihtoehtoisia hoitomuotoja bakteeritaudeille. Yksi keino on bakteerien virulenssitekijöiden, kuten eksotoksiinien, kohdentaminen. Eksotoksiineilla on usein keskeinen osuus taudin aiheuttamisessa, mikä tekee niistä hyviä lääkekehityskohteita. Eksotoksiinien yksityiskohtainen ymmärtäminen on tärkeää uusien hoitomuotojen kehittämisessä.
Tämä tutkimus keskittyy pertussistoksiiniin (PT), joka on hinkuyskää aiheuttavan Bordetella pertussis -bakteerin tärkeä virulenssitekijä. PT on ADP-ribosyyli-transferaasi (ART), joka häiritsee soluviestintää siirtämällä ADP-riboosin nikotiiniadeniinidinukleotidilta (NAD+) isäntäsolun G-proteiinin inhibitoriseen α-alayksikköön, johtaen moniin systeemisiin häiriöihin. Tavoitteena oli löytää pienmolekyylisiä yhdisteitä, jotka estävät PT:n ART-toimintaa, ja tutkia atomitasolla PT:n rakennetta yhdisteiden sitoutumisen sekä ART-toiminnan kannalta.
Tässä työssä kehitettiin erittäin tehokas PT:n toimintaa estävien pienmolekyylisten yhdisteiden in vitro -seulontamenetelmä, jolla löydettiin kaksi PT:n aktiivisuutta estävää pienmolekyylistä yhdistettä. Ne osoittautuivat tehokkaiksi matalina pitoisuuksina in vitro, ja toinen on tehokas myös elävissä soluissa. Näille yhdisteille ei saatu kiderakennetta, mutta rakenteet saatiin PT:lle yhdessä NAD+, sen hydrolyysituotteiden ADP-riboosin ja nikotiininamidin, NAD+ analogi PJ34:n (ART-inhibiittori) sekä uuden NAD+ analogin kanssa, joka muodostui kiteytettäessä 3-aminobentsamidia (ART-inhibiittori) ja NAD+:ia. Nämä rakenteet antavat uutta tietoa PT:n ART-toiminnasta NAD+-hydrolyysin eri vaiheissa ja luovat pohjaa PT:n ART-toimintaa estävien yhdisteiden rationaaliselle lääkesuunnittelulle sekä PT:n käytölle biokatalyyttisena alustana uuden NAD+ analogin tuottamiseen biokemiallisiin ja rakenteellisiin kokeisiin NAD+:ia sitovien proteiinien kanssa.
Yhteenvetona tämä väitöstyö löysi pienmolekyylisiä yhdisteitä, jotka estävät PT:n toimintaa ja tarjoaa atomitason rakenteellista tietoa PT:n ART-toiminnasta sekä sitoutumisesta tunnettujen ART-entsyymejä inhiboivien pienmolekyylisten yhdisteiden kanssa. Tämä tieto voi auttaa sekä rationaalisen lääkesuunnittelun menetelmien että PT:lle suunnattuja pienimolekyylisten yhdisteiden kehittämisessä.
AVAINSANAT: hinkuyskä, pertussistoksiini, ADP-ribosyylitransferaasi, inhibiittori, lääkehehitys
Kokoelmat
- Väitöskirjat [2889]