N-Methoxyoxazolidineligation in oligonucleotides

Abstract

Vedessä tapahtuvia kytkentäreaktioita hyödynnetään modernissa lääkekehityksen kemiassa ja bioteknologisissa sovelluksissa. Esimerkiksi DNA-templatoidun synteesin avulla valmistetaan laajoja molekyylikirjastoja, jotka sisältävät jopa triljoonia erilaisia yhdisteitä. Kirjastojen avulla voidaan tehokkaasti löytää uusia lääkeainekandidaatteja. Tällaisia kandidaatteja sekä muita kemiallisia reseptoreita sekä ligandeja voidaan valmistaa myös dynaamisella kombinatorisella kemialla. Dynaaminen kombinatorinen kemia hyödyntää tasapainoreaktioita, joiden tuotesuhdetta voidaan ohjata spesifisesti sitoutuvilla vastinrakenteilla eli templaateilla. Dynaamisen kombinatorisen kemian etuna on aktiivisten yhdisteiden samanaikainen synteesi ja seulonta. Biologisesti aktiivisten aineiden seulonta dynaamisella kombinatorisella kemialla vaatii vedessä tapahtuvia reversiibeleitä kytkentäreaktioita. Tällaisia kytkentäreaktioita hyödynnetään myös lääkeainekonjugaattien valmistukseen, jossa vaikuttavaan lääkeaineeseen kiinnitetään apuryhmä, jonka tehtävänä on edesauttaa lääkeaineen kuljetusta tiettyyn kohteeseen elimistössä, tehostaen näin lääkeaineen vaikutusta.

Tässä väitöskirjassa tutkittiin N-metoksioksatsolidiinin käyttöä oligonukleotidien ligaatiota. Tutkimalla 2´-deoksi-2´-N-metoksiuridiinin ja aldehydien välistä reaktiota, havaittiin, että N-metoksioksatsolidiinit muodostuivat tehokkaasti vesiliuoksessa. Tämä kondensaatioreaktio oli reversiibeli ja sen nopeus riippui liuoksen happamuudesta. Käytännössä reaktio oli dynaaminen lievästi happamissa olosuhteissa (pH 4–6), mutta tuotteet olivat pysyviä pH 7:ssa ja sen yläpuolella. N-metoksioksatsolidiinia hyödynnettiin terapeuttisesti relevanttien oligonukleotidikonjugaattien valmistukseen, jotka purkaantuivat endosomeille tyypillisissä happamissa olosuhteissa. Tällä perusteella N-metoksioksatsolidiineja voitaisiin käyttää kytkentärakenteena lääkeaineiden kuljetukseen kohdesoluihin. Toisena sovellusalueena tutkittiin N-metoksioksatsolidiinin käyttöä DNA- ja pienmolekyylitemplatoidussa synteesissä. Osoitettiin, että sekä komplementaarista DNA-juostetta tai pienmolekyyliä voitiin käyttää indusoimaan oligonukleotidien välistä N-metoksioksatsolidiiniligaatiota. N-metoksioksatsolidiiniligaatio osoittautui siis toimivaksi työkaluksi dynaamisen kombinatorisen kemian tutkimuksiin oligonukleotidella.

------------

Aqueous coupling reactions are used in modern medicinal chemistry and biotechnological applications. As an example, DNA-templated synthesis (DTS) is employed to generate massive chemical libraries up to trillions of compounds, which can be utilized for screening of new active pharmaceutical ingredients (APIs). Furthermore, high-affinity receptors and ligands can be discovered by performing the synthesis and screening in a single process called target-directed dynamic combinatorial chemistry (tdDCC), which is based on settling of a thermodynamic equilibrium directed by the targets of interests – the templates. Reversible template-induced assembly is also attractive for detection as chemical sensors. tdDCC with biological target requires reversible aqueous coupling reactions. These kinds of coupling reactions have also been used as linkers for conjugation of APIs with various cell-specific or membrane-penetrating molecular agents to increase the efficacy of the API by more efficient cellular uptake.

In this thesis, formation of N-methoxyoxazolidines is presented as a potential pH-responsive coupling chemistry suitable for tdDCC and conjugation of unprotected oligonucleotides. By studying a model reaction between 2´-deoxy-2´-N-methoxyuridine and aldehydes, it was found out that N-methoxyoxazolidines are obtained in high yields under aqueous conditions. The reaction is reversible, and its rate is dependent on the acidity of the reaction solution. In practice, the reaction is dynamic under slightly acidic conditions (pH 4–6) while the obtained products (N-methoxyoxazolidines) are stable at pH 7 or above. The N-methoxyoxazolidine formation was applied for the preparation of various oligonucleotide conjugates (including carbohydrates and peptides). The conjugates were shown to be cleavable in acidic conditions perceived to early endosomes. Based on these studies, N-methoxyoxazolidines could be used as dynamic cleavable linkers for therapeutic oligonucleotide conjugates. In addition, the applicability of the reaction for DNA- and small-molecule-templated syntheses were studied. This was demonstrated for the assembly of dynamic pH-responsive split-aptamers and G-quadruplexes, induced by a small molecule substrate and metal ions, respectively. Therefore, N-methoxyoxazolidine was proven to be a suitable tool for tdDCC.