Bacterial signaling molecules as regulators of gingival cells̕ behavior

Abstract

Cyclic dinucleotides, cyclic di-adenosine monophosphate (c-di-AMP) and cyclic di-guanosine monophosphate (c-di-GMP) are bacterial signaling molecules essential for regulating various bacterial cellular processes. Host cells can recognize cytosolic nucleic acids and cyclic dinucleotides through a stimulator of interferon genes (STING). Such recognition can stimulate the immune response by activating the production of interferons and other pro-inflammatory cytokines. Nevertheless, the impact of bacterial cyclic dinucleotides on the cellular response of gingival cells remains unknown.

The objectives of this PhD study series were to 1) investigate the regulatory roles of bacterial cyclic dinucleotides and Porphyromonas gingivalis (Pg) lipopolysaccharides (LPS) on the cellular response of human gingival keratinocytes (HMK) and human gingival fibroblasts (HGFs), 2) evaluate cyclic dinucleotide-mediated activation of STING/TANK-binding kinase1 (TBK1)/interferon regulatory factor 3 (IRF3) pathway in HMK cells, and 3) examine the effects of cyclic dinucleotides solely or combined with Pg LPS on gingival fibroblasts' proteome response by using global proteomics analysis.

In the experiments, HMK and HGF cells were stimulated with (100, 10, 1 μM) of c-di-AMP and c-di-GMP. Cytokine expressions of HMK cells and cytokine and matrix metalloproteinase expressions of HGF cells were evaluated by the Luminex technique. Expressions of mitogen-activated protein kinases and STING/TBK1/IRF3 pathway activation in HMK cells and HGFs were measured with western blot. The gingival fibroblasts' proteome response against bacterial cyclic dinucleotides was studied using proteomics analysis.

Our results showed that cyclic dinucleotides can either enhance or inhibit LPS-regulated HMK cytokine response, and this variation depends on the type of cytokine. Moreover, STING/TBK1/IRF3 pathway operates within HMK cells and can be regulated by bacterial cyclic dinucleotides. In HGFs, cyclic dinucleotides interacted with Pg LPS to control the early cellular response, while Pg LPS predominantly influenced the late cellular response. Bacterial cyclic dinucleotides solely or with Pg LPS upregulated innate immunity-related and interferon signaling-related proteins in HGFs, in addition to controlling various other critical processes.

The results of this PhD project suggest that bacterial cyclic dinucleotides, which are previously unstudied components of periodontal bacteria, can regulate initial cellular response of gingival cells through STING/TBK1/IRF3 pathway. A thorough description of cyclic dinucleotide-regulated cellular responses in periodontium may allow us to design cyclic dinucleotide analogues that can function as STING-agonists, antagonists, and potential therapeutics.

<b>Bakteerien signalointimolekyylit iensolujen käyttäytymisen säätelijöinä</b>

Sykliset dinukleotidit, syklinen di-adenosiinimonofosfaatti (c-di-AMP) ja syklinen di-guanosiinimonofosfaatti (c-di-GMP) ovat bakteerien signalointimolekyylejä, jotka ovat olennaisia monenlaisten bakteerien soluprosessien säätelyssä. Isäntäsolut kykenevät tunnis-tamaan sytosoliset nukleiinihapot ja sykliset dinukleotidit interferonigeenien stimulaattorin (STING) kautta. Tällainen tunnistus voi stimuloida immuunivastetta aktivoimalla inter-feronien ja muiden proinflammatoristen sytokiinien tuotantoa. Bakteerien syklisten dinukleotidien vaikutus iensolujen soluvasteeseen on kuitenkin edelleen tuntematon.

Tämän väitöskirjatutkimuksen tavoitteina oli tutkia bakteerien syklisten dinukleotidien ja Porphyromonas gingivalis bakteerin lipopolysakkaridien (Pg-LPS) säätelytehtävää ihmisen ienkeratinosyyttien (HMK) ja ienfibroblastien (HGF) soluvasteessa sekä arvioida syklisen dinukleotidin välittämää STING/TANK-sitovan kinaasi1 (TBK1)/interferonin säätelytekijä 3 (IRF3) -reitin aktivointia HMK-soluissa. Näiden lisäksi tutkittin syklisen dinukleotidin vaikutusta joko yksinään tai yhdessä Pg-LPS:en kanssa ienfibroblastien proteomivasteeseen käyttäen globaalia proteomistaanalyysiä.

Kaikissa kokeissa HMK- ja HGF-soluja stimuloitiin c-di-AMP- ja c-di-GMP- dinukleo-tideillä (pitoisuudet 100, 10 ja 1 μM). HMK-solujen sytokiini-ilmentymiä ja HGF-solujen sytokiini- ja matriisimetalloproteinaasi-ilmentymiä mitattiin Luminex-tekniikalla. HMK- ja HGF-solujen mitogeenien aktivoimia proteiinikinaaseja ja STING/TBK1/IRF3-reitin akti-vointia mitattiin immunobloteilla. Ienfibroblastien proteomivastetta bakteerien syklisiä dinukleotideja vastaan tutkittiin proteomisella analyysillä.

Tulokset osoittivat, että syklisten dinukleotidien tyypistä riippuen ne kykenevät joko lisäämään tai estämään LPS:en sytokiinivastetta. Sen lisäksi osoittautui, että STING/TBK1/IRF3-reitti toimii HMK-soluissa ja sitä voivat säädellä bakteerien sykliset dinukleotidit. HGF-soluissa sykliset dinukleotidit vuorovaikuttivat Pg-LPS:en kanssa kontrolloiden varhaista soluvastetta, kun taas yksinään Pg-LPS vaikutti pääasiassa myöhäiseen soluvasteeseen. Bakteerien sykliset dinukleotidit yksinään tai yhdessä Pg-LPS:en kanssa säätelevät synnynnäiseen immuniteettiin ja interferonisignalointiin liittyviä proteiineja sekä kontrolloivat useita muita kriittisiä prosesseja HGF-soluissa.

Tämän väitöskirjatutkimuksen mukaan aiemmin tutkimattomat parodontaalibakteerien komponentit, sykliset dinukleotidit, voivat säädellä iensolujen alkuvaiheen soluvastetta STING/TBK1/IRF3-reitin kautta. Perusteellinen kuvaus syklisten dinukleotidien säätely-vaikutuksista iensolujen soluvasteeseen saattaa mahdollistaa syklisten dinukleotidianalogien suunnittelun. Tämänkaltaiset analogit voisivat toimia STING-agonisteina, -antagonisteina ja mahdollisina terapeuttisina aineina.