The Mechanism of transcript elongation: Substrate selection and proofreading by the multi-subunit RNA polymerase

Abstract

RNA polymerases (RNAPs) synthesize RNA using DNA or RNA as a template. Accurate RNA synthesis is essential for cellular functions and viral RNA replication, so RNAPs actively select the right nucleotides by probing for nucleobase and nucleosugar moieties. RNAPs transcribing cellular genomes are large multi-subunit enzymes, whereas mitochondrial genomes are transcribed by structurally distinct single-subunit RNAPs. Viral RNAPs from RNA viruses are distantly related to mitochondrial RNAPs, but they use RNA as a template. Nucleoside analogues that mimic the canonical ribonucleotide triphosphate substrates (rNTPs) can be used to inhibit the RNAPs of pathogens. The mechanism of substrate selection by all RNAPs needs to be studied in great mechanistic detail to optimize analogues for selective targeting. This thesis work elucidates the mechanisms of nucleosugar selection and transcriptional proofreading by multi-subunit RNAPs, and provides insights into the nucleobase selectivity mechanism by different RNAP structural families. First, we found that multi-subunit RNAPs differentiate nucleosugar in ribo- and deoxyribonucleoside triphosphates (2’dNTPs) by utilizing the invariant arginine residue. This residue promotes rNTP binding, but also disfavors 2’dNTP incorporation into the RNA by stabilizing the catalytically inert 2’-endo conformation of the nucleosugar. Second, we delineated the contributions of various regions of the active site for proofreading activity of multi-subunit RNAPs. Third, we evaluated the suitability of six nucleoside analogues as substrates for multisubunit, mitochondrial and viral RNAPs. These RNAPs utilized the nucleoside analogues with different efficiencies and specificity. Several nucleoside analogues acted as dual coders, mimicking more than one canonical nucleobase. In particular, our data suggests that formycin A is a potent dual coder that may induce mutations during viral RNA synthesis. Overall, our results highlight the differences in substrate selection by cellular, mitochondrial and viral RNAPs, providing valuable information for the design of medically relevant transcription inhibitors.

<b>RNA-transkriptin pidentymisen mekanismi: substraatin selektio ja oikoluku monialayksikköisessä RNA-polymeraasissa</b>

RNA-polymeraasit (RNAP:t) syntetisoivat RNA:ta käyttäen DNA:ta tai RNA:ta mallina. Tarkka RNA:n synteesi on välttämätöntä solun toiminnoille ja virusten RNA:n kahdentamiselle, joten RNAP:t valitsevat aktiivisesti oikeita nukleotidejä niiden emäs- ja sokeriosien perusteella. Solujen genomia transkriptoivat RNAP:t ovat suuria monialayksikköisiä entsyymejä, kun taas mitokondrioiden genomeja transkriptoivat rakenteellisesti erilaiset, pienemmät RNAP:t. RNA-virusten RNAP:t ovat kaukaista sukua mitokondrion RNAP:lle, mutta ne käyttävät RNA:ta mallina. Ribonukleosiditrifosfaatteja matkivat nukleosidianalogit voivat estää taudinaiheuttajien RNAP:ien toimintaa. RNAP:ien substraatin valinnan mekanismia on tutkittava yksityiskohtaisesti, jotta analogit voidaan optimoida kohdistumaan taudinaiheuttajiin. Tämä väitöskirjatyö selventää substraatin valinnan ja transkription oikoluvun mekanismeja monialayksikköisissä RNAP:eissa, ja antaa uutta tietoa siitä, miten eri perheisiin kuuluvat RNAP:t tunnistavat nukleotidien emäsosia.

Ensiksi selvitimme, että monialayksikköiset RNAP:t erottavat ribo- ja deoksiribonukleosiditrifosfaattien sokeriosat toisistaan konservoituneen arginiinin avulla. Tämä aminohappotähde auttaa ribonukleosiditrifosfaattia sitoutumaan, mutta myös estää deoksiribonukleosiditrifosfaattien liittämistä RNA:han stabiloimalla sen sokeriosan katalyyttisesti inerttiä 2'-endo-konformaatiota. Toiseksi, tutkimme monialayksikköisen RNAP:n aktiivisen keskuksen eri alueiden osallistumista transkription oikolukuun. Kolmanneksi, arvioimme kuuden nukleosidianalogin soveltuvuutta monialayksikköisten, mitokondriaalisten ja virusten RNAP:ien substraatteina. Nämä RNAP:it käyttivät nukleosidianalogeja substraatteina eri tehokkuuksilla ja tarkkuudella. Useat nukleosidianalogit toimivat kaksoiskoodaajina, matkien useampaa kuin yhtä ribonukleosiditrifosfaattia. Erityisesti formysiini A:n havaittiin olevan tehokas kaksoiskoodaaja, joka saattaa aiheuttaa mutaatioita viruksen RNA:n synteesin aikana. Tuloksemme korostavat, miten monialayksikköisten, mitokondriaalisen ja virusten RNAP:t eroavat toisistaan substraatin emäsosan tunnistuksessa, tarjoten arvokasta tietoa lääketieteellisesti merkittävien transkription estäjien suunnittelua varten.