Advancing antibody engineering: Development of a novel Bxb1 landing pad-based mammalian display platform for the selection of biophysically favorable antibodies

Abstract

Owing to their high clinical success rate, advancements in biotechnology, and increased understanding of disease mechanisms, therapeutic antibodies have become an important modality for the treatment of many diseases. Therapeutic antibodies are engineered and recombinantly produced immunoproteins that specifically recognize cell surface proteins to, for example, block proliferation signaling or activate and target immune cells toward tumor cells. In addition to having high specificity and affinity towards their intended target, therapeutic antibodies must exhibit low aggregation propensity, high thermal and colloidal stability, and high solubility to ensure efficient drug manufacturing, storage, and administration.

Recent reports have shown the correlation between antibody display level achieved on mammalian cell surface and the biophysical properties of the antibody. To facilitate the high-throughput selection of developable antibodies, a novel mammalian display platform utilizing a Bxb1 integrase-based landing pad in Chinese hamster ovary (CHO) cells was developed in this thesis. As the primary limitation of mammalian display is its limited library size, the genomic integration efficiency of the developed platform was substantially improved by enhancing the nuclear localization of Bxb1 integrase. To provide further evidence supporting the ability of mammalian display to distinguish between antibodies with differing biophysical properties, the correlation between these properties and the display level on mammalian cells was assessed using 37 clinical-stage antibodies. Additionally, the applicability of the platform was demonstrated by improving the biophysical properties of two antibodies using both rational and random mutagenesis strategies. Finally, to overcome the stable genomic integration bottleneck, a method for inducing random mutations near the complementary determining regions of the antibody in situ was developed. This was achieved by incorporating G-quadruplex structures in the antibody gene and coupling somatic hypermutation with mammalian display.

As demonstrated in this thesis, this novel mammalian display platform can be adopted by biopharmaceutical laboratories to discover and engineer antibodies with favorable biophysical properties.

<b>Vasta-ainemuokkauksen edistäminen: Uuden Bxb1 integraasiin perustuvan nisäkässoluilmentämisalustan kehittäminen biofysikaalisesti suotuisten vasta-aineiden valintaa varten</b>

Terapeuttisista vasta-aineista on tullut tärkeä hoitomuoto monien sairauksien hoidossa, johtuen niiden hyvästä kliinisestä menestyksestä, bioteknologian kehittymisestä ja sairauksien mekanismien lisääntyneestä ymmärryksestä. Terapeuttiset vasta-aineet ovat rekombinanttisesti tuotettuja immunoproteiineja, jotka tunnistavat spesifisesti solun pintaproteiineja esimerkiksi estääkseen syöpäsolujen lisääntymissignaaleja tai aktivoidakseen immuunisoluja tuhoamaan niitä. Hyvän spesifisyyden ja sitoutumisvoimakkuuden lisäksi terapeuttisten vasta-aineiden on osoitettava matalaa aggregoitumistaipumusta, korkeaa stabiiliutta sekä korkeaa liukoisuutta, jotta lääkkeen tehokas valmistus, säilytys ja annostelu voidaan varmistaa.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet korrelaation nisäkässolupinnan vasta-aineiden ilmentymistasojen ja vasta-aineiden biofysikaalisten ominaisuuksien välillä. Tässä väitöskirjassa kehitettiin uusi nisäkässoluilmentämisalusta, joka hyödyntää Bxb1-integraasiin perustuvaa stabiilia integraatiota kiinalaisissa hamsterin munasarjasoluissa (CHO-solut), joka mahdollistaa biofysikaalisesti suotuisten vasta-aineiden tehokkaan valinnan. Kehitetyn alustan genomisen integraation tehokkuutta parannettiin merkittävästi lisäämällä Bxb1-integraasin tumalokaalisoitumista. Lisäksi väitöskirjassa annettiin lisää näyttöä nisäkässoluilmentämisalustan kyvystä erottaa vasta-aineet, joilla on erilaisia biofysikaalisia ominaisuuksia, tutkimalla näiden ominaisuuksien ja ilmentymistasojen välistä korrelaatiota käyttäen 37 kliinisessä vaiheessa olevaa vasta-ainetta. Alustan sovellettavuus osoitettiin parantamalla kahden vasta-aineen biofysikaalisia ominaisuuksia sekä rationaalisella että satun-naisella mutageneesistrategialla. Väitöskirjassa myös kehitettiin menetelmä satun-naisten mutaatioiden aikaansaamiseksi vasta-aineen hypervariaabelialueen läheisyyteen. Tämä saavutettiin sisällyttämällä G4 rakenteita vasta-ainegeeniin ja yhdistämällä somaattinen hypermutaatio nisäkässoluilmentämisalustaan.

Tässä väitöskirjassa osoitettiin monipuolisesti kehitetyn uuden nisäkäs-soluilmentämisalustan kyky valita biofysikaalisesti suotuisia vasta-aineita, jota voidaan hyödyntää lääkekehityksessä.