A cell spot microarray method for high-throughput biology

Abstract

High-throughput screening of cellular effects of RNA interference (RNAi) libraries is now being increasingly applied to explore the role of genes in specific cell biological processes and disease states. However, the technology is still limited to specialty laboratories, due to the requirements for robotic infrastructure, access to expensive reagent libraries, expertise in high-throughput screening assay development, standardization, data analysis and applications. In the future, alternative screening platforms will be required to expand functional large-scale experiments to include more RNAi constructs, allow combinatorial loss-of-function analyses (e.g. genegene or gene-drug interaction), gain-of-function screens, multi-parametric phenotypic readouts or comparative analysis of many different cell types. Such comprehensive perturbation of gene networks in cells will require a major increase in the flexibility of the screening platforms, throughput and reduction of costs. As an alternative for the conventional multi-well based high-throughput screening -platforms, here the development of a novel cell spot microarray method for production of high density siRNA reverse transfection arrays is described. The cell spot microarray platform is distinguished from the majority of other transfection cell microarray techniques by the spatially confined array layout that allow highly parallel screening of large-scale RNAi reagent libraries with assays otherwise difficult or not applicable to high-throughput screening. This study depicts the development of the cell spot microarray method along with biological application examples of high-content immunofluorescence and phenotype based cancer cell biological analyses focusing on the regulation of prostate cancer cell growth, maintenance of genomic integrity in breast cancer cells, and functional analysis of integrin protein-protein interactions <i>in situ.</i>

RNA-interferenssin (RNAi) käyttö geenituotteiden toimintojen tutkimuksessa on vuosikymmenessä kehittynyt solubiologisen tutkimuksen merkittävimpien teknologioiden joukkoon. RNAi-menetelmät ovat mahdollistaneet myös eri solubiologisten signaalivälitysreittien kartoittamisen koko perimänlaajuisten geenitoimintojen suurtehoseulonnan avulla. Teknologian nopeasta kehityksestä ja laajamittaisesta hyödyntämisestä huolimatta, RNAi-menetelmien käyttö suurtehoseulontaan rajoittuu edelleen erikoislaboratorioihin huomattavien laite-, reagenssi- sekä tietotaitovaatimusten johdosta. Lisäksi yleisimmin käytetyt kuoppalevypohjaiset seulonta-menetelmät rajoittavat seulontatutkimusten laajuutta, eri analyysimenetelmien käyttöä sekä useiden mallisolulinjojen rinnakkaista seulontaa suuren reagenssikulutuksen takia. RNAi-suurtehoseulonnan kustannuksien ja laiteriippuvuuden alentamiseksi sekä monipuolisuuden lisäämiseksi tulevaisuudessa tarvitaan uusia vaihtoehtoisia seulontamenetelmiä. Tämän väitöskirjatyön lähtökohtana oli uuden kuoppalevyillä tehtäviä seulontamenetelmiä edullisemman ja monipuolisemman RNAi-suurtehoseulontamenetelmän kehittäminen. Tutkimuksessa kehitettiin solujen siRNA käänteistransfektioon perustuva solumikrosirumenetelmä, joka tarkasti rajattujen siRNA näytepisteiden avulla mahdollistaa jopa koko ihmisen perimänlaajuisten siRNA näytekirjastojen seulonnan yksittäisellä mittasirulla. Menetelmän suuri näytetiheys sekä sirujen pieni pinta-ala mahdollistavat myös erikoismittamenetelmien käytön suurtehoseulonnassa, jotka teknisistä tai kustannussyistä eivät sovellu käytettäväksi suurtehoseulontaan kuoppalevyillä. Väitöskirjan ensimmäinen osatyö kuvaa menetelmän kehittämistyön. Väitöskirjan toisessa, kolmannessa ja neljännessä osatyössä menetelmää on hyödynnetty syöpäbiologisissa seulontatutkimuksissa selvitettäessä geenejä jotka vaikuttavat eturauhassyöpäsolujen kasvuun, rintasyöpäsolujen solunjakautumiseen sekä integriini tarttumisreseptorien aktiivisuuden säätelyyn.