Upconverting diagnostics: Multiplex assays utilizing upconversion luminescence technology

Abstract

Conventional diagnostics tests and technologies typically allow only a single analysis and result per test. The aim of this study was to propose robust and multiplex array-inwell test platforms based on oligonucleotide and protein arrays combining the advantages of simple instrumentation and upconverting phosphor (UCP) reporter technology. The UCPs are luminescent lanthanide-doped crystals that have a unique capability to convert infrared radiation into visible light. No autofluorescence is produced from the sample under infrared excitation enabling the development of highly sensitive assays.

In this study, an oligonucleotide array-in-well hybridization assay was developed for the detection and genotyping of human adenoviruses. The study provided a verification of the advantages and potential of the UCP-based reporter technology in multiplex assays as well as anti-Stokes photoluminescence detection with a new anti- Stokes photoluminescence imager. The developed assay was technically improved and used to detect and genotype adenovirus types from clinical specimens. Based on the results of the epidemiological study, an outbreak of adenovirus type B03 was observed in the autumn of 2010.

A quantitative array-in-well immunoassay was developed for three target analytes (prostate specific antigen, thyroid stimulating hormone, and luteinizing hormone). In this study, quantitative results were obtained for each analyte and the analytical sensitivities in buffer were in clinically relevant range. Another protein-based array-inwell assay was developed for multiplex serodiagnostics. The developed assay was able to detect parvovirus B19 IgG and adenovirus IgG antibodies simultaneously from serum samples according to reference assays. The study demonstrated that the UCPtechnology is a robust detection method for diverse multiplex imaging-based array-inwell assays.

Perinteiset diagnostiset testit mahdollistavat vain yhden analyysin ja tuloksen määritystä kohden. Väitöskirjatyöni tavoitteena oli kehittää uudenlaisia järjestelmä kuopassa tyyppisiä mallintavia monianalyyttimäärityksiä, joissa yhdestä näytteestä yhdessä reaktiokaivossa voidaan mitata samanaikaisesti useita analyyttejä ja niiden pitoisuuksia. Kehitetyt monianalyyttimääritykset perustuvat sekä nukleiinihappojen että proteiinien mittaukseen hyödyntäen leimoina valoa tuottavia epäorgaanisia lantanidi-ioneja sisältäviä loisteainepartikkeleita (UCP). Näillä partikkeleilla on ainutlaatuinen kyky virittyä matalaenergisen infrapunavalon vaikutuksesta ja emittoida korkeaenergisen näkyvän valon aallonpituuksilla, mikä mahdollistaa autofluoresenssista vapaan mittauksen ja näin ollen herkkien määrityksien kehityksen.

Väitöskirjatyössäni kehitin adenoviruksille DNA-tyypitysmäärityksen, joka perustui yksinauhaisen PCR-tuotteen ja adenovirus-tyyppispesifisten koettimien väliseen hybridisaatioreaktioon mikrotiitterilevyn kaivon pohjalla. Tulokset osoittivat, että UCP-leimateknologia ja uusi anti-Stokes luminesenssin kuvantamiseen kehitetty laite soveltuvat monianalyttimääritysten kvantitatiiviseen mittaukseen. Teknisesti parannettua adenovirusten DNA-tyypitysmenetelmää hyödynnettiin kliinisesti merkittävien adenovirustyyppien havaitsemisessa ja genotyypityksessä. Adenovirusinfektioiden epidemiologinen seuranta osoitti, että adenovirus tyyppi B03 aiheutti epidemian syksyllä 2010. Väitöskirjatyössäni kehitin myös kvantitatiivisen mallintavan monianalyytti-immunomäärityksen kolmelle antigeenille. Määrityksessä kaikille analyyteille saatiin kvantitatiivinen tulos, ja analyyttiset herkkyydet olivat kliinisesti merkittävällä alueella. Lisäksi väitöskirjatyössäni kehitin serologisen monianalyyttimäärityksen, jonka avulla mitattiin seerumista IgG-luokan adenovirusja parvovirus B19-vasta-aineita samanaikaisesti. Serologinen monianalyyttimääritys validoitiin näytepaneelilla ja tulokset korreloivat hyvin adenovirus IgG ja parvovirus B19 IgG referenssi-entsyymi-immunomäärityksien kanssa. Väitöskirjatyössäni osoitin, että UCP-teknologia soveltuu sekä oligonukleotidi- että proteiini-pohjaisten monianalyyttimääritysten kvantitatiiviseen kuvantamiseen.