Kolesterolioksidaasin entsyymikinetiikka ja pitoisuusmittaus kasvatusliuoksesta

Abstract

Kolesteroli on eläinten elämälle välttämätön molekyyli, jolla on kriittinen rooli solujen toiminnan kannalta muun muassa solukalvojen rakenteessa ja hormonien tuotannossa. Kolesterolioksidaasi on kolesterolin hapettumista ja isomerisaatiota katalysoiva entsyymi, jota käytetään esimerkiksi kolesterolipitoisuusmittauksissa. On tärkeää mitata kolesterolipitoisuutta, sillä se toimii veressä merkkiaineena sekä liian suurilla että pienillä pitoisuuksilla useille eri sairauksille, kuten sydän- ja verisuonisairauksille, jotka ovat yleisin kuolinsyy länsimaissa. Tämän vuoksi ei olekaan yllättävää, että kolesterolioksidaasi on toiseksi käytetyin entsyymi kliinisissä laboratorioissa. Entsyymien tutkimukseen liittyen tärkeimpien asioiden joukkoon lukeutuu entsyymikinetiikka, jossa mitataan entsyymin katalysoiman reaktion nopeutta.

Tässä työssä tutkittiin erään Streptomyces lavendulae -bakteerikannan tuottamaa kolesterolioksidaasientsyymiä. Entsyymin kinetiikan tutkimiseksi sitä tuotettiin Escherichia coli- kannalla, johon oli lisättynä entsyymiä tuottavan geenin sisältävä tuottovektori. Geeniin oli liitettynä histidiinihäntää koodaava sekvenssi helpottamaan proteiinin puhdistusta. Kolesterolioksidaasin aktiivisuutta mitattiin spektrofotometrisesti ja mittauksista analysoitiin joko signaalin voimakkuutta tai muutosnopeutta.

Entsyymi onnistuttiin puhdistamaan ja puhtautta arvioitiin SDS-PAGE-geeliajolla. Entsyymikineetikan tuloksiksi saatiin seuraavat arvot: KM 15,9 μM, Vmax 4,9 μM/min ja kcat 10,35 1/s. Nämä arvot ovat yhdenmukaisia muiden kolesterolioksidaasi tutkimusten kanssa. Lisäksi vertailtiin Streptomyces lavendulae -bakteerikannan kolesterolioksidaasin tuottoa tutkimusryhmän valmistamiin Streptomyces -tuottokantoihin ja näiden villityyppikantoihin. Streptomyces lavendulae -bakteerikannan entsyymin saannoksi saatiin 0,82 U/ml. Muilla tuottokannoilla ei havaittu merkittävää määrä entsyymin tuottoa.

Cholesterol is a molecule that is essential for all animal life and has critical roles in the functions of the cell, including determination of the structure of the cell membrane and hormone production. Cholesterol oxidase, that catalyzes the oxidation and isomerization of cholesterol, is an enzyme that is used for example in cholesterol measurement. Measuring cholesterol is vital due to its property to work as a tracer in both high and low concentrations for multiple diseases like cardiovascular diseases that are the leading cause of death in Western world. Because of this, it is not surprising that cholesterol oxidase is the second most used enzyme in clinical laboratories. In enzyme research, one of the most important aspects is enzyme kinetics since this typically determines the viability of the assay systems. Enzyme kinetics measures the velocity of the reaction catalyzed by the enzyme.

The aim of this work was to study the cholesterol oxidase produced by a Streptomyces lavendulae -strain. To study enzyme kinetics, the enzyme was produced in a heterologous Escherichia coli host containing a vector that included the cholesterol oxidase gene. The gene encoded an additional histidine tag sequence to simplify purification of the recombinant protein. Cholesterol oxidase activity was measured spectrophotometrically, and either the signal intensity or the rate of change was analyzed.

The enzyme was successfully produced and purified, and the purity was assessed with SDS-page gel run. Basic kinetic parameters with the following values were determined: KM 15,9 μM, Vmax 4,9 μM/min ja kcat 10,35 1/s. These results are in line with values obtained from other microbial cholesterol oxidases. In addition, production of the choleterol oxidase was compared between wild type Streptomyces lavendulae, other Streptomyces production strains, made by the research group, and their native strains. Streptomyces lavendulae -strain enzyme yield was 0,82 U/ml. The other strain did not produce significant amount of cholesterol oxidase.