In silico epitooppimallinnus : proteiiniepitooppien tunnistaminen seuraavan sukupolven sekvensointidatasta
Seppänen, Merimari (2021-04-22)
In silico epitooppimallinnus : proteiiniepitooppien tunnistaminen seuraavan sukupolven sekvensointidatasta
(22.04.2021)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
suljettu
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2021052531463
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2021052531463
Tiivistelmä
Epitooppimallinnuksessa pyritään löytämään proteiinista vasta-aineen sitoutumiskohtia eli epitooppeja, joiden tuntemisesta on hyötyä esimerkiksi rokotteiden ja terapeuttisten vasta-aineiden löytämisessä ja kehittämisessä sekä diagnostiikassa. Tehokas työkalu tähän on faaginäyttötekniikka, jossa bakteriofageissa ilmennettävää vasta-ainekirjastoa rikastetaan kohdeantigeeniä vastaan, kirjastosta poimitaan satunnaisesti klooneja, jotka sekvensoidaan, ja sekvenssejä tarkastellaan edelleen in silico.
Seuraavan sukupolven sekvensointitekniikoilla (engl. next generation sequencing, NGS) voidaan sekvensoida suuria DNA-määriä tehokkaasti ja suhteellisen edullisesti. NGSmenetelmillä faaginäyttötekniikka tehostuu, kun yksittäisten kloonien sijaan voidaan sekvensoida kokonainen faaginäyttökirjasto. Nanohuokossekvensointi on lupaava NGSmenetelmä, jonka etuja on pitkät lukupituudet, helppo näytteenkäsittely ja kannettava laite. Nanohuokossekvensointia ei ole vielä juuri sovellettu vasta-ainekehitykseen.
Tässä työssä pyrittiin ottamaan käyttöön biotekniikan osaston uusi MinIONnanohuokossekvensointilaite, sekä soveltamaan eri sekvensointimenetelmiä vastaainekirjastojen sekvensointiin käyttäen malliantigeeninä prostataspesifistä antigeeniä (engl. prostate specific antigen, PSA). Faaginäyttökirjastosta valmistettiin viivakoodattu kirjasto, joka soveltuu sekvensointiin niin nanohuokossekvensoinnilla kuin MiSeqillä. Tämän lisäksi poimittiin yksittäisiä klooneja, jotka Sanger-sekvensoitiin.
Faaginäyttöselektiot tehtiin onnistuneesti viidellä eri epitooppeihin sitoutuvalla vastaaineella ja näistä valmistettiin laadukas NGS-kirjasto. Yksittäistä Sanger-sekvensoiduista klooneista löydettiin uusia PSA-spesifisiä vasta-aineita, joille myös arvioitiin epitoopit. MinION saatettiin käyttövalmiiksi ja sillä ajettiin kontrolliajo, josta saatu data vastasi laadultaan kirjallisuudesta löytyviä tuloksia. Varsinaista kirjastoa ei tämän työn puitteissa onnistuttu ajamaan MinIONilla eikä MiSeqillä, vaan ajot tulee toistaa käyttäen eri puhdistusmenetelmää. Epitope mapping is a process of identifying particular areas, epitopes, on antigen surfaces that are recognized by antibodies. Knowing the epitopes for specific antibodies is important in discovery and development of vaccines and therapeutic antibodies as well as in diagnostics. An effective and widely used method for epitope mapping is phage display, in which an antibody library is displayed on bacteriophages and panned against a target antigen. A selection of clones is picked and sequenced, and the sequences are further analyzed in silico.
Next generation sequencing (NGS) methods are relatively cost-efficient, high throughput methods for sequencing large amounts of DNA. NGS-methods can be used to support phage display by screening the whole library in stead of a few dozen handpicked clones. Nanopore sequencing is a quite novel, promising NGS method, that enables long reads with simple sample preparation and portable sequencing device. Nanopore sequencing has not yet been widely applied in antibody development.
The objective in this thesis work was to bring into use the new MinION nanopore sequencer at the biotechnology unit of University of Turku. Model antigen used in this work was prostate specific antigen (PSA) since it is well studied, and it has many mapped epitopes. Novel antibodies against PSA were produced by phage display with five different capture antibodies and sequenced with MiSeq, Nanopore and Sanger sequencing.
Novel PSA specific antibodies were discovered among hand-picked, Sanger sequenced clones and their epitopes were predicted. A control run on MinION was conducted, and the data quality was similar to earlier reports. The NGS library was of good quality, but the sequencing was not successful with either MiSeq or MinION within the context of this work. The library must be sequenced anew using different sample preparation and purification methods.
Seuraavan sukupolven sekvensointitekniikoilla (engl. next generation sequencing, NGS) voidaan sekvensoida suuria DNA-määriä tehokkaasti ja suhteellisen edullisesti. NGSmenetelmillä faaginäyttötekniikka tehostuu, kun yksittäisten kloonien sijaan voidaan sekvensoida kokonainen faaginäyttökirjasto. Nanohuokossekvensointi on lupaava NGSmenetelmä, jonka etuja on pitkät lukupituudet, helppo näytteenkäsittely ja kannettava laite. Nanohuokossekvensointia ei ole vielä juuri sovellettu vasta-ainekehitykseen.
Tässä työssä pyrittiin ottamaan käyttöön biotekniikan osaston uusi MinIONnanohuokossekvensointilaite, sekä soveltamaan eri sekvensointimenetelmiä vastaainekirjastojen sekvensointiin käyttäen malliantigeeninä prostataspesifistä antigeeniä (engl. prostate specific antigen, PSA). Faaginäyttökirjastosta valmistettiin viivakoodattu kirjasto, joka soveltuu sekvensointiin niin nanohuokossekvensoinnilla kuin MiSeqillä. Tämän lisäksi poimittiin yksittäisiä klooneja, jotka Sanger-sekvensoitiin.
Faaginäyttöselektiot tehtiin onnistuneesti viidellä eri epitooppeihin sitoutuvalla vastaaineella ja näistä valmistettiin laadukas NGS-kirjasto. Yksittäistä Sanger-sekvensoiduista klooneista löydettiin uusia PSA-spesifisiä vasta-aineita, joille myös arvioitiin epitoopit. MinION saatettiin käyttövalmiiksi ja sillä ajettiin kontrolliajo, josta saatu data vastasi laadultaan kirjallisuudesta löytyviä tuloksia. Varsinaista kirjastoa ei tämän työn puitteissa onnistuttu ajamaan MinIONilla eikä MiSeqillä, vaan ajot tulee toistaa käyttäen eri puhdistusmenetelmää.
Next generation sequencing (NGS) methods are relatively cost-efficient, high throughput methods for sequencing large amounts of DNA. NGS-methods can be used to support phage display by screening the whole library in stead of a few dozen handpicked clones. Nanopore sequencing is a quite novel, promising NGS method, that enables long reads with simple sample preparation and portable sequencing device. Nanopore sequencing has not yet been widely applied in antibody development.
The objective in this thesis work was to bring into use the new MinION nanopore sequencer at the biotechnology unit of University of Turku. Model antigen used in this work was prostate specific antigen (PSA) since it is well studied, and it has many mapped epitopes. Novel antibodies against PSA were produced by phage display with five different capture antibodies and sequenced with MiSeq, Nanopore and Sanger sequencing.
Novel PSA specific antibodies were discovered among hand-picked, Sanger sequenced clones and their epitopes were predicted. A control run on MinION was conducted, and the data quality was similar to earlier reports. The NGS library was of good quality, but the sequencing was not successful with either MiSeq or MinION within the context of this work. The library must be sequenced anew using different sample preparation and purification methods.