Non-invasiivisen prenataaliseulonnan toiminnallisuuden kehittäminen
Korpela, Fanny (2022-06-08)
Non-invasiivisen prenataaliseulonnan toiminnallisuuden kehittäminen
(08.06.2022)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
suljettu
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2022062749743
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe2022062749743
Tiivistelmä
Sikiön kehityksen aikana kromosomisto voi kehittyä virheellisesti, joka johtaa poikkeavaan kromosomimäärään. Poikkeavuudet aiheuttavat sikiölle ominaisuuksia, joista osa voi olla sikiölle hengenvaarallisia. Tässä työssä perehdyttiin non-invasiivisen prenataaliseulontalaitteen (NIPT) toimintaan, millä seulotaan sikiön kromosomipoikkeavuuksia (trisomia13/18/21/Y/X). Menetelmä perustuu soluvapaaseen DNA:han, jota vapautuu sikiöstä äidin verenkiertoon. NIPT hyödyntää liikkuvan ympyrän replikaatiota (RCA), mikä vaatii useita entsyymejä analysoitavien RCA tuotteiden (RCP) muodostumiseksi. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutustua menetelmässä käytettävien raaka-aineiden, erityisesti koentsyymin, detergentin, backbone oligon sekä leimauspuskurin toimintaan ja niiden toiminnan optimoinnin kautta parantaa määritysmenetelmän toimivuutta ja tulosten luotettavuutta.
Alhaisen pH:n on havaittu vaikuttavan ligaasin toimintaan negatiivisesti ja se nähdään signaalitason heikkenemisenä ajan funktiona. Reaktioon testattiin vaihtoehtoisia koentsyymejä, joista valmistettujen mastermixien pH oli korkeampi. Niiden vaikutus signaalitasoon oli merkittävä; signaalitaso pysyi tasaisena läpi levyn, kun koentsyyminä käytettiin vaihtoehtoisista reagensseista puhtainta.
Reaktiossa nykyisin käytettävän detergentin pH on riippuvainen lämpötilasta, minkä vuoksi sen stabilointi on haastavaa. Reaktioon testattiin kahta vaihtoehtoista detergenttiä. Detergentti 1 toimi hyvin samankaltaisesti nykyisin käytössä olevan detergentin kanssa. Tulosten perusteella detergentti 2 taas toimi paremmin hybridisaatiopuskurissa. Detergentti 1 tai 2 ei myöskään muodostanut sakkaa pakastus-sulatus -syklin jälkeen.
Backbone oligo -erien puhtaustaso vaihtelee ja sen on havaittu heikentävän määrityksen luotettavuutta. Backbone oligon puhtausasteen merkitystä määrityksen toimivuuteen testattiin puhdistamalla eriä kahdella eri keräysikkunalla. Saatujen tulosten perusteella backbone oligon tulee olla mahdollisimman puhdasta, jotta se toimii määrityksessä optimaalisesti.
Aikaisemmin suoritetuissa tutkimuksissa on havaittu, että X-kromosomin tausta on määrityksessä korkea, mikä alentaa sen havaitsemisherkkyyttä. Ongelman korjaamiseksi taustaa pyrittiin laskemaan parantamalla havaitsemisoligon ja RCP:n sitoutumisen spesifisyyttä muuttamalla leimauspuskurin suolakoostumusta. Suolakoostumuksen vaikutus havaittiin parhaiten X- ja Y-kromosomien taustassa.
Alhaisen pH:n on havaittu vaikuttavan ligaasin toimintaan negatiivisesti ja se nähdään signaalitason heikkenemisenä ajan funktiona. Reaktioon testattiin vaihtoehtoisia koentsyymejä, joista valmistettujen mastermixien pH oli korkeampi. Niiden vaikutus signaalitasoon oli merkittävä; signaalitaso pysyi tasaisena läpi levyn, kun koentsyyminä käytettiin vaihtoehtoisista reagensseista puhtainta.
Reaktiossa nykyisin käytettävän detergentin pH on riippuvainen lämpötilasta, minkä vuoksi sen stabilointi on haastavaa. Reaktioon testattiin kahta vaihtoehtoista detergenttiä. Detergentti 1 toimi hyvin samankaltaisesti nykyisin käytössä olevan detergentin kanssa. Tulosten perusteella detergentti 2 taas toimi paremmin hybridisaatiopuskurissa. Detergentti 1 tai 2 ei myöskään muodostanut sakkaa pakastus-sulatus -syklin jälkeen.
Backbone oligo -erien puhtaustaso vaihtelee ja sen on havaittu heikentävän määrityksen luotettavuutta. Backbone oligon puhtausasteen merkitystä määrityksen toimivuuteen testattiin puhdistamalla eriä kahdella eri keräysikkunalla. Saatujen tulosten perusteella backbone oligon tulee olla mahdollisimman puhdasta, jotta se toimii määrityksessä optimaalisesti.
Aikaisemmin suoritetuissa tutkimuksissa on havaittu, että X-kromosomin tausta on määrityksessä korkea, mikä alentaa sen havaitsemisherkkyyttä. Ongelman korjaamiseksi taustaa pyrittiin laskemaan parantamalla havaitsemisoligon ja RCP:n sitoutumisen spesifisyyttä muuttamalla leimauspuskurin suolakoostumusta. Suolakoostumuksen vaikutus havaittiin parhaiten X- ja Y-kromosomien taustassa.