Pancreatic cancer specific nanoparticles aided glycovariant assays

Abstract

Pancreatic cancer is among the most lethal malignancies. Cancer antigen 19.9 is the most used and best-validated serum tumor marker for PanCa diagnosis. However, several critical aspects impede its clinical use, such as false-negative results in subjects with Lewis (a-b-) phenotype and false-positive elevation in patients with benign diseases. Cancer-derived extracellular vesicles are strongly glycosylated, being rich in specific glycoconjugates such as integrins, tetraspanins, and mucins, and they reflect the cell of origin. In this study, we first optimized and clinically evaluated the CA125WGA glycovariant assay previously identified from PanCa cell-line glyco-profiling. Second, we profiled glycoconjugates from passively coated purified EVs and soluble protein enriched fractions from PanCa, benign pancreatitis, and healthy serum pools in collaboration with FastEV company. With our cohort of patient samples (n = 15), we were able to increase signals of the most problematic samples, i.e., false-negative PanCa and false-positive benign, with anti-CA125 Fab fragments as biotinylated capture and WGA-conjugated europium-nanoparticles as tracer. In the optimized CA125WGA GV assay the discrimination of problematic samples was p = 0.164, and for healthy and benign p = 0.014 and for healthy and PanCa p = 0.002. We also found that CA19.9, DC-SIGN, UEA and ITGA4 -NPs significantly bind with EVs compared to SP enriched fraction. Based on profiling data we further developed sandwich GV assays of ITGA4. While observed discrimination was insignificant between PanCa and benign, they did complement to conventional CA19.9 EIA i.e., detecting false negative PanCa and not detecting false positive benign. This study suggests that GV assays have superior performance and improved specificity in the detection of cancers, and that GV assays could be used complementarily in combination with conventional assays.

Haimasyöpä on yksi tappavimmista ja pahanlaatuisimmista sairauksista. Syöpäantigeeni 19.9, joka tunnetaan myös sialyyli Lewis A antigeeninä, on eniten käytetty ja parhaiten validoitu seerumin kasvainmarkkeri haimasyöpädiagnoosissa. Muutamat kriittiset ominaisuudet kuitenkin estävät sen kliinistä käyttöä, kuten väärät negatiiviset tulokset henkilöillä, joilla on Lewis (a-b-) fenotyyppi, ja väärä positiivinen nousu potilailla, joilla on hyvänlaatuisia sairauksia, kuten haimatulehdus. Syövästä peräisin olevat solunulkoiset vesikkelit ovat voimakkaasti glykosyloituneita, ja ne sisältävät runsaasti spesifisiä glykokonjugaatteja, kuten integriineja, tetraspaniineja ja musiineja, ja ne heijastavat alkuperäisen solun tilaa. Tässä tutkimuksessa optimoimme ja arvioimme kliinisesti ensin solulinja glykoprofiloinnista aiemmin tunnistetun CA125WGA glykovarianttimäärityksen. Toiseksi profiloimme glykokonjugaatteja passiivisesti päällystetyistä puhdistetuista EV:istä ja liukoisilla proteiineilla rikastetuista haimasyövän, haimatulehduksen ja terveiden seerumipoolien fraktioista yhteistyössä FastEV yhtiön kanssa. Kliinisten näytteiden kohorttimme (n = 15) avulla pystyimme nostamaan ongelmallisimpien näytteiden, eli väärän negatiivisen haimasyövän ja väärän positiivisen haimatulehduksen, signaaleja käyttämällä anti-CA125 Fab fragmentteja biotinyloituna kiintokantajana ja WGA-konjugoituja europium-nanopartikkeleja leimana. Optimoidussa CA125WGA GV määrityksessä ongelmallisten näytteiden erottelu oli p = 0.164, terveiden kontrollien ja haimatulehduksen erottelu oli p = 0.014 ja terveiden kontrollien ja haimasyövän erottelu oli p = 0.002. Huomasimme myös, että CA19.9, DC-sign, UEA ja ITGA4 -nanopartikkelit sitoutuvat merkittävästi EV:hin verrattuna SP-rikastettuun fraktioon. Profilointitietojen perusteella kehitimme edelleen ITGA4 sandwich-GV määrityksiä. Vaikka GV määrityksillä havaittu erottelu haimasyövän ja haimatulehduksen välillä oli tilastollisesti merkityksetöntä, ne täydensivät tavanomaista CA19.9 entsyymi-immunomääritystä, eli ne havaitsivat väärän negatiivisen haimasyövän ja eivät havainneet väärää positiivista haimatulehdusta. Tämä tutkimus viittaa siihen, että GV määrityksillä on parempi suorituskyky ja parempi spesifisyys syöpien havaitsemisessa, ja että GV määrityksiä voitaisiin käyttää komplementaarisesti yhdessä tavanomaisten määritysten kanssa.