Kromosomin 12 trisomian vaikutus ihmisen pluripotentteihin kantasoluihin ja indusoidun kantasolulinjan luominen

Abstract

Pluripotenteilla kantasoluilla on kyky erilaistua jokaiseksi ihmiskehon solutyypiksi. Pluripotentteja alkion kantasoluja voidaan eristää blastokystivaiheen alkion sisäsolumassasta. Indusoituja pluripotentteja kantasoluja puolestaan saadaan uudelleenohjelmoimalla somaattisia soluja takaisin kantasoluiksi. Pluripotentteja kantasoluja voidaan ylläpitää soluviljelmänä periaatteessa loputtomasti niiden ikuisen jakautumiskyvyn vuoksi. Solulinjat voivat kuitenkin ajan myötä adaptoitua soluviljelyyn ja niiden genomiin saattaa tulla spesifisiä muutoksia. Yleisin pluripotenttisiin kantasoluihin kertyvä muutos on kromosomin 12 trisomia, joka on yleinen myös syövässä. Trisomia 12 -solut syrjäyttävät nopeasti normaalit diploidit kantasolut ja sen vuoksi kyseisen trisomian on ajateltu antavan soluille merkittävän valintaedun.

Työssä tutkittiin kromosomin 12 trisomian vaikutusta pluripotenttien kantasolujen kasvunopeuteen ja proteiinituotantoon. Tutkimus tehtiin käyttäen ihmisen pluripotentteja kantasolulinjoja, joita verrattiin niiden autologisiin trisomia 12 alalinjoihin. Ennen varsinaisten tutkimuksien aloitusta, solulinjojen genotyypit validoitiin karyotyyppauksella ja FISH (eng. Fluorescence In Situ Hybridization) -menetelmällä. Solujen kokonaisproteiini sekä erittyvien proteiinien määrää tutkittiin SILAC (eng. Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture) -menetelmällä, jossa endogeeniset proteiinit leimataan isotooppileimatuilla aminohapoilla ja proteiinit tunnistetaan ja niiden määrät määritetään massaspektrometrialla. Lisäksi tavoitteena oli indusoida uusia pluripotentteja kantasoluja uudelleenohjelmoimalla ihmisen fibroblasteja genomiin integroitumattoman Sendai-virusvektorin avulla, joka kantaa OCT3/4-, SOX2-, KLF4- ja C-MYC-transkriptiofaktoreita.

Solupesäkkeiden kasvunopeus oli merkitsevästi nopeampaa trisomia 12 -alalinjoissa verrattuna diploideihin. Myös alalinjojen proteiinituotanto erosi toisistaan sekä kokonaisproteiinin että eritettyjen proteiinien eli sekretomin osalta. Kokonaisproteiinista löydettiin 38 ja sekretomista 20 mahdollisesti kromosomin 12 trisomiaan liittyvää proteiinia. Jokin näistä proteiineista voi olla trisomia 12 -soluille spesifinen markkeri, jota voitaisiin tulevaisuudessa hyödyntää esim. syöpädiagnostiikassa. Uudelleenohjelmoinnin seurauksena saatiin tuotettua morfologialtaan pluripotenttien kantasolujen kaltaisia soluja ihon fibroblasteista. Uudelleenohjelmoinnin onnistumisen myötä tekniikkaa voidaan jatkossa soveltaa esimerkiksi syöpäsolulinjoihin ja tuottaa syöpäkantasolujen kaltaisia soluja ja siten hyödyntää tekniikkaa syöpätutkimuksessa.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are able to differentiate into all cell types of the human body. Human embryonic stem cells (hESCs) can be isolated from the inner cell mass of the blastocyst stage embryo whereas induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from somatic cells. Both of these pluripotent stem cell types can be maintained in cell culture, and they have an endless ability to divide. In time, pluripotent stem cells can adapt in culture and acquire genomic changes to their DNA. The most frequent change that accumulates in pluripotent stem cells is trisomy 12, which is also common in cancer. Trisomy 12 cells replace and take over normal diploid cells rapidly in culture. Therefore, Trisomy 12 is beneficial for the cells and gives them a clear selection advantage.

In this study, the effects of trisomy 12 in hPSCs were studied with proteomics. Three pairs of HESC lines with trisomy 12 were compared to their autologous karyotypically normal subline. First, genotypes and the growth rates of the sublines were verified with karyotyping and FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). The total proteome and secretome were examined with SILAC (Stable Isotope Labeling by Amino acids in Cell culture) which marks the endogenous proteins with isotope-tagged amino acids. In addition, the second aim of this thesis was to generate a new induced pluripotent cell line by reprogramming human fibroblasts with Sendai virus vector-based overexpression of OCT3/4, SOX2, KLF4, and C-MYC transcription factors.

The growth of the cell colonies was significantly faster in trisomy 12 cell lines compared to normal diploid sublines. Importantly, significant alterations in total protein and secretome production were detected. In total, trisomy 12 significantly affected the production of 38 proteins and 20 of the secreted proteins. One of these proteins could be a specific marker for trisomy 12 cells and might have potential in cancer diagnostics in the future. Reprogramming changed the morphology of the fibroblasts to pluripotent stem cell-like colonies and new cell lines were generated. Therefore, reprogramming was successful, and the technique can be utilized next for example to cancer cell lines to model cancer stem cells.