Hapteenisitojavasta-ainekirjaston Laajennus

Abstract

Hapteenit ovat pieniä molekyylejä, jotka aiheuttavat immuunivasteen vain, kun ne sitoutuvat suurempaan konjugaattiin, Hapteeneihin sitoutuminen on haastavaa, sillä tyypilliset vasta-aineet eivät tunnista pieniä molekyylejä ja yleensä päätyvät itse hapteeni-inhiboiduiksi. Turun Yliopistossa aikaisemmin rakennetun scFvM -nimisen hapteenisitojavasta-ainekirjaston tarkoituksena on mahdollistaa sitojien kehittäminen erityyppisille hapteeneille. Vasta-ainekirjasto on sitä hyödyllisempi, mitä suurempi ja monipuolisempi se on. Työn tarkoituksena oli laajentaa nykyistä kirjastoa ottamalla käyttöön uusi kevyen ketjun KV2-28 runkorakenne, jonka valmistusta ei ollut vielä testattu käytännössä. Kirjasto valmistettiin uusilla alukkeilla tehdyillä FASTR-reaktioilla ja kirjaston laatu karakterisoitiin sekvensoimalla. Valmiiksi saadun kirjaston toimivuutta oli tarkoitus testata rikastamalla siitä hapteenia sitovia vasta-aineita. Työ aloitettiin diversifoimalla kevyen ketjun kirjaston CDR-L1, -L2 ja -L3 alueet. scFv-muotoon transformaation jälkeen, kyseinen kirjasto sitten yhdistettiin nykyisestä scFvM-kirjastosta monistetun raskaan ketjun kanssa. Lopullisen kirjaston transformaatiossa kooksi saatiin 1.33 x 1011 pesäkettä, mikä on erinomainen tulos kirjaston tyypilliseen tavoitekokoon verrattuna. Sekvensoinnin klooneista suurin osa (noin 80%) oli onnistuneita ja omasivat ehjän lukukehyksen. Vaikka kirjastojen tuotto oli onnistunutta, faagitiitteri jäi liian vähäiseksi, jolloin tarkistettiin eri keinoilla mitkä tekijät olisivat mahdollisesti haitanneet kasvua. Itse kirjaston infektio auttajafaagilla onnistui heikosti, verrattuna Escherichia coli soluihin, joissa ei ollut plasmidia. Faagien kehnolle tuotolle ei löytynyt muuta ratkaisevaa päätelmää, muuta kuin että itse faagit olivat laadultaan kehnoja.

Haptens are small molecules that cause an immune response only when they are bound to a larger conjugate. Binding to haptens is challenging, as typical antibodies do not recognize small molecules and usually end up being hapten-inhibited themselves. The purpose of the scFvM hapten-binding antibody library, which was previously built at the University of Turku, is to enable the development of binders for different types of haptens. The larger and more versatile the antibody library is, the more useful it is. The purpose of the work was to expand the current library by introducing a new light chain KV2-28 frame structure, the production of which had not yet been tested in practice. The library was prepared using FASTR reactions with new primers and the quality of the library was characterized by sequencing it. The functionality of the completed library was to be tested by enriching it with hapten-binding antibodies. The work started by diversifying the CDR-L1, - L2 and -L3 regions of the light chain library. After transformation into the scFv form, that library was then combined with the heavy chain amplified from the existing scFvM library. In the transformation of the final library, a size of 1.33 x 1011 colonies were obtained, which is an excellent result compared to the typical target size of the library. Most of the sequencing clones (about 80%) were successful and had an intact reading frame. Although the yield of the libraries was successful, the phage titer remained too low, so the different means with which factors would have possibly hindered the growth were checked. Infection of the library itself with the helper phage was poor, compared to Escherichia coli cells without the plasmid. No other decisive conclusion was found for the poor yield of the phages, other than the phages themselves having poor quality.