Tunnistussilmukan kiinnittymisen ja sekvensointikirjastojen optimointi syövän diagnostiikassa
Ojaniemi, Rita (2023-10-03)
Tunnistussilmukan kiinnittymisen ja sekvensointikirjastojen optimointi syövän diagnostiikassa
(03.10.2023)
Julkaisu on tekijänoikeussäännösten alainen. Teosta voi lukea ja tulostaa henkilökohtaista käyttöä varten. Käyttö kaupallisiin tarkoituksiin on kielletty.
suljettu
Julkaisun pysyvä osoite on:
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe20231103143046
https://urn.fi/URN:NBN:fi-fe20231103143046
Tiivistelmä
Syöpä on yksi johtavimmista kuolinsyistä maailmanlaajuisesti ja Suomessakin siihen sairastuu yli 36 000 ihmistä vuosittain. Sen aikainen havaitseminen lisää parantumisen mahdollisuuksia ja vähentää hoidosta kertyviä kustannuksia.
Uuden sukupolven sekvensoinnilla (engl. Next generation sequencing, NGS) on ollut suuri merkitys syövän diagnostiikassa jo nyt. Menetelmän herkkyys, nopeus ja alhaiset näytekohtaiset kustannukset tekevät menetelmästä kilpailukykyisen muihin diagnostiikkamenetelmiin verrattuna.
Diplomityössä optimoitiin tunnistussilmukan (Indexing-Loop) kiinnittymistä silta-koetinkompleksiin. Tunnistussilmukka-silta-koetinkompleksilla pyydystetään genomialueet, joissa on kliinisesti merkittäviä mutaatioita, jonka jälkeen muodostunut kompleksi voidaan monistaa pyörivän ympyrän monistuksen (engl. rolling circle amplification, RCA) ja PCR:n avulla. RCA tekee lineaarisen monistuksen, joka helpottaa sekvensointikirjastojen luomista. Sekvensoinnin jälkeen sekvensointidatasta haetaan tiettyjä kliinisesti merkittäviä mutaatioita.
Työssä kehitettiin tunnistussilmukka, jonka lopullisena tarkoituksena on saada käytössä olevista kaupallisista sekvensointimenetelmistä skaalattavampia ja edullisempia. Tämä on mahdollista, koska tunnistussilmukan avulla potilasnäytteet voidaan merkitä tunnetuilla sekvenssijuosteilla ja yhdistää eri näytteet yhteen jo menetelmäprotokollan varhaisessa vaiheessa. Prosessi yksinkertaistuu merkittävästi, jolloin myös reagensseja kuluu huomattavasti vähemmän. Siten kaupalliseen sekvensointiin mahtuu enemmän potilasnäytteitä kuin ennen ja samassa ajassa voidaan saada yhä useampi diagnoosi. Menetelmä sopii erityisesti syöpien aikaiseen diagnosointiin sekä seurantaan.
Tunnistussilmukka saatiin kiinnittymään siltakoetinkompleksiin ja sekvensointikirjaston tuottamasta datasta pystyttiin todistamaan kirjastojen puhtaus. Kiinnittymisen optimoinnissa kokeiltiin erilaisia entsyymejä ja eri määriä PCR-syklejä. Tunnistussilmukallisten silta-koetinkompleksien määräksi saatiin 92,8 %. Onnistunut tunnistussilmukan kiinnittyminen takaa paremman suoriutumisen skaalattavuudessa, pienemmät näytekohtaiset kustannukset, ja mahdollisuuden käsitellä suuremman määrän näytteitä samassa sekvensoinnissa. Cancer is one of the leading causes of death worldwide. More than 36 000 people in Finland got diagnosed with cancer in 2021. Its early detection increases the chances of recovery and reduces the costs of treatment.
Next generation sequencing (NGS) platforms have had a huge impact on cancer diagnostics. The sensitivity, speed and low cost per sample make the method attractive compared to other diagnostic methods.
The thesis focused on optimizing the attachment of the Indexing-Loop to the bridge-probe-complex. Genomic regions with clinically significant mutations are captured using the Indexing-Loop bridge probe complex. Subsequently, the formed complex can be replicated using rolling circle amplification (RCA) and PCR. RCA enables linear replications, facilitating the creation of sequencing libraries. After sequencing, specific clinically significant mutations are sought from the sequencing data.
In the study, an Indexing-Loop was developed with the goal of making commercially available sequencing platforms more scalable and cost effective. This is achievable because the Indexing-Loop allows patient samples to be labelled with known sequence tags and pooled early in the method protocol. The process is significantly streamlined, resulting in a considerably reduced consumption of reagents. As a result, more patient samples can be accommodated in commercial sequencing, and a greater number of diagnoses can be obtained in the same amount of time. The method is particularly useful for early diagnosis and monitoring of cancers.
The indexing-loop was successfully attached to the bridge-probe-complex and the clearness of sequencing libraries was demonstrated from the generated sequencing data. In the optimization of the Indexing-Loop attachment, various enzymes, and different PCR cycle numbers were tested. The quantity of bridge probe complexes with Indexing-Loops was increased and up to 92,8 %. It will ensure improved performance in scalability, lower per-sample costs, and the ability to process a greater number of samples in the same sequencing run.
Uuden sukupolven sekvensoinnilla (engl. Next generation sequencing, NGS) on ollut suuri merkitys syövän diagnostiikassa jo nyt. Menetelmän herkkyys, nopeus ja alhaiset näytekohtaiset kustannukset tekevät menetelmästä kilpailukykyisen muihin diagnostiikkamenetelmiin verrattuna.
Diplomityössä optimoitiin tunnistussilmukan (Indexing-Loop) kiinnittymistä silta-koetinkompleksiin. Tunnistussilmukka-silta-koetinkompleksilla pyydystetään genomialueet, joissa on kliinisesti merkittäviä mutaatioita, jonka jälkeen muodostunut kompleksi voidaan monistaa pyörivän ympyrän monistuksen (engl. rolling circle amplification, RCA) ja PCR:n avulla. RCA tekee lineaarisen monistuksen, joka helpottaa sekvensointikirjastojen luomista. Sekvensoinnin jälkeen sekvensointidatasta haetaan tiettyjä kliinisesti merkittäviä mutaatioita.
Työssä kehitettiin tunnistussilmukka, jonka lopullisena tarkoituksena on saada käytössä olevista kaupallisista sekvensointimenetelmistä skaalattavampia ja edullisempia. Tämä on mahdollista, koska tunnistussilmukan avulla potilasnäytteet voidaan merkitä tunnetuilla sekvenssijuosteilla ja yhdistää eri näytteet yhteen jo menetelmäprotokollan varhaisessa vaiheessa. Prosessi yksinkertaistuu merkittävästi, jolloin myös reagensseja kuluu huomattavasti vähemmän. Siten kaupalliseen sekvensointiin mahtuu enemmän potilasnäytteitä kuin ennen ja samassa ajassa voidaan saada yhä useampi diagnoosi. Menetelmä sopii erityisesti syöpien aikaiseen diagnosointiin sekä seurantaan.
Tunnistussilmukka saatiin kiinnittymään siltakoetinkompleksiin ja sekvensointikirjaston tuottamasta datasta pystyttiin todistamaan kirjastojen puhtaus. Kiinnittymisen optimoinnissa kokeiltiin erilaisia entsyymejä ja eri määriä PCR-syklejä. Tunnistussilmukallisten silta-koetinkompleksien määräksi saatiin 92,8 %. Onnistunut tunnistussilmukan kiinnittyminen takaa paremman suoriutumisen skaalattavuudessa, pienemmät näytekohtaiset kustannukset, ja mahdollisuuden käsitellä suuremman määrän näytteitä samassa sekvensoinnissa.
Next generation sequencing (NGS) platforms have had a huge impact on cancer diagnostics. The sensitivity, speed and low cost per sample make the method attractive compared to other diagnostic methods.
The thesis focused on optimizing the attachment of the Indexing-Loop to the bridge-probe-complex. Genomic regions with clinically significant mutations are captured using the Indexing-Loop bridge probe complex. Subsequently, the formed complex can be replicated using rolling circle amplification (RCA) and PCR. RCA enables linear replications, facilitating the creation of sequencing libraries. After sequencing, specific clinically significant mutations are sought from the sequencing data.
In the study, an Indexing-Loop was developed with the goal of making commercially available sequencing platforms more scalable and cost effective. This is achievable because the Indexing-Loop allows patient samples to be labelled with known sequence tags and pooled early in the method protocol. The process is significantly streamlined, resulting in a considerably reduced consumption of reagents. As a result, more patient samples can be accommodated in commercial sequencing, and a greater number of diagnoses can be obtained in the same amount of time. The method is particularly useful for early diagnosis and monitoring of cancers.
The indexing-loop was successfully attached to the bridge-probe-complex and the clearness of sequencing libraries was demonstrated from the generated sequencing data. In the optimization of the Indexing-Loop attachment, various enzymes, and different PCR cycle numbers were tested. The quantity of bridge probe complexes with Indexing-Loops was increased and up to 92,8 %. It will ensure improved performance in scalability, lower per-sample costs, and the ability to process a greater number of samples in the same sequencing run.