Käänteiskopiointi-PCR:n reaktio-olosuhteiden optimointi uutta infektiotestijärjestelmää varten

Abstract

Infektiotaudit eli tartuntataudit ovat ihmisten yleisimpiä sairauksia ja merkittävä taakka yhteiskunnalle ja yksilölle. Taudinaiheuttajan tunnistaminen luotettavasti ja oikea-aikaisesti mahdollistaa tehokkaan hoidon ja tartuntaketjun katkaisun. Kvantitatiivinen käänteiskopiointipolymeraasiketjureaktio (RT-PCR) on vakiintunut, pikadiagnostiikkaan soveltuva molekulaarinen menetelmä. Toimeksiantona oli optimoida RT-PCR-kemiaa terveysteknologiayhtiö Uniogenissa kehitteillä olevaa, infektiotautien pikadiagnostiikkaan tarkoitettua testijärjestelmää varten. PCR-reagenssit kuivataan reaktiokammiona toimivalle muovilastulle. Tavoitteena oli löytää kaupallisia glyserolittomia käänteiskopioijia ja DNA-polymeraaseja, jotka soveltuvat kuivaukseen ja käytettäväksi uudessa testijärjestelmässä. Entsyymien tulee säilyä lastulle kuivattuna huoneenlämmössä vähintään vuoden ajan. Työssä testattiin 38:aa entsyymiparia analysoimalla useita mallianalyyttejä yksivaiheisella, 30 minuutin pituisella RT-PCR-määrityksellä, joka perustui hydrolyysikoetinteknologiaan. Reaktio-olosuhteiden vertailu pohjautui signaali-taustasuhteeseen ja kynnyssykliin. Optimointia jatkettiin lupaavimmilla entsyymeillä. Lisäksi valmistettiin 10 kuivalastuerää, joiden säilyvyyttä huoneenlämmössä (+28 °C) ja jääkaapissa (+4 °C) seurattiin 60 päivän ajan. Signaali-taustasuhde ja kynnyssykliarvot olivat 60 päivän säilytyksen jälkeen tavoitellulla tasolla, eikä tulosten perusteella havaittu merkittävää eroa huoneenlämpösäilytyksen ja jääkaappisäilytyksen välillä. Laajemmat tulkinnat parhaista entsyymeistä ja reaktiokompositioista voidaan tehdä vasta tulevien optimointien ja pidemmän säilyvyystestauksen jälkeen. Diplomityön lopputuloksena löydettiin hyvin yhteensopivia entsyymejä ja PCR-puskureita, jotka alustavien tulosten perusteella soveltuvat käytettäväksi uudessa infektiotestijärjestelmässä.

Infectious diseases are among the most prevalent diseases globally and cause serious health and economic burdens. Timely and accurate detection of pathogens allows for the initiation of appropriate treatment and the transmission chain to be stopped. Quantitative reverse transcription PCR (RT-PCR) is one of the most-established methods applicable to rapid diagnostics. In this work, RT-PCR conditions were optimised for a new molecular testing system for rapid infectious disease diagnostics, which is being developed by Uniogen, a healthtech company. PCR reagents are dried onto a plastic test chip where the reaction takes place. The aim of the work was to find commercial glycerol-free reverse transcriptases and DNA polymerases suitable for the dry chemistry to be used with the new system. The enzymes should remain stable after drying for at least one year when stored at room temperature. A total of 38 enzyme pairs were compared in 30-minute hydrolysis probe-based RT-PCR using several model analytes. Reaction conditions were compared based on the signal-to-noise ratio and threshold cycle values. The enzyme pairs with the highest performance were selected for further optimisation. Ten pairs of enzymes were dried on PCR test chips, the stability of which at ambient (+28 °C) and refrigerated (+4 °C) temperatures was monitored for 60 days. The signal-to-noise ratio and threshold cycle values were at the target level after 60 days of storage, and no significant difference was observed between room temperature storage and refrigerator storage. Regardless, future optimisation and stability testing will confirm the most robust and stable enzyme combination and optimal reaction composition. In summary, several potential enzyme pairs and PCR buffers for the new testing system were discovered.