C1q:n häiriö polyakryylihappo-pintaisiin käänsteisviritteisiin nanopartikkeleihin perustuvassa immunomäärityksessä

Abstract

Immunomääritykset ovat biokemiallisia testejä, jotka perustuvat vasta-aineiden erinomaiseen kykyyn tunnistaa spesifisesti molekyylejä biologisista näytteistä. Immunomäärityksiä käytetään laajasti sairauksien diagnostiikassa, lääkekehityksessä ja muussa tutkimuksessa. Erityisesti monoklonaaliset vasta-aineet ovat mahdollistaneet immunomääritysten kehittämisen hyvin herkiksi ja toistettaviksi. Erinomaisten vasta-aineiden lisäksi immunomääritykset tyypillisesti tarvitsevat leimatekniikan, joka tuottaa mitattavaa signaalia ja mahdollistaa analyytin konsentraation mittaamisen. Yksi tämän hetken kiinnostavista leimatekniikoista on käänteisviritteiset nanopartikkelit, jotka mahdollistavat tausta-autofluoresenssista vapaan mittauksen. Tämä teoriassa mahdollistaa jopa yksittäisen leiman erottamisen näytteestä. Käytännössä herkkyyttä kuitenkin rajoittaa leiman epäspesifinen sitoutuminen. Lisäksi immunomääritykset ovat herkkiä erilaisille näytteen komponenttien aiheuttamille häiriöille. Häiriöt voivat vääristää immunomäärityksen tulosta ja aiheuttaa vääriä positiivisia tai vääriä negatiivisia tuloksia, mikä voi johtaa vääränlaiseen hoitoon.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa plasmanäytteessä positiivista häiriötä aiheuttava tekijä kaksivaiheisessa heterogeenisessa immunomäärityksessä, kun leimana käytetään polyakryylihappo-pintaisia käänteisviritteisiä nanopartikkeleita. Häiriötä aiheuttavaa tekijää rikastettiin fraktioimalla litium-hepariiniplasmaa ammoniumsulfaattisaostuksella, geelisuodatuskromatografialla ja anioninvaihtokromatografialla. Fraktiot analysoitiin troponiini I-immunomäärityksessä, josta tunnistettiin fraktiot, joissa oli häiriötä aiheuttavaa tekijää läsnä. Lopullinen tunnistus tehtiin geelielektroforeesilla ja massaspektrometrialla.

Häiriötä aiheuttavaksi tekijäksi tunnistettiin komplementin ensimmäisen tekijän osa C1q. C1q on komplementin klassisen tien tunnistusproteiini, jonka tehtävä on tunnistaa patogeeneihin sitoutuneita vasta-aineita ja patogeenien pintarakenteita veressä. C1q aiheuttamaa häiriötä onnistuttiin vähentämään lisäämällä näytepuskuriin hepariinia tai nostamalla puskurin suolapitoisuutta. C1q:ssa on useita voimakkaasti positiivisesti varautuneita domeeneja, jotka mahdollisesti reagoivat elektrostaattisesti partikkelin pinnalla olevan polyakryylihapon kanssa. C1q:n tunnistaminen häiriötä aiheuttavaksi tekijäksi mahdollistaa kohdennettujen vastatoimien kehityksen tulevaisuudessa.

Immunoassays are biochemical tests based on an antibody's ability to recognize and bind a specific molecule, called an analyte, in biological samples. Immunoassays are used in a wide variety of applications, such as disease diagnosis, drug discovery studies and other research areas. Especially, the development of monoclonal antibodies has accelerated the development of high sensitivity and robust immunoassays. In addition, immunoassays require labelling techniques that enable signal generation and measurement of analyte concentrations. High specific activity labels facilitate the development of high sensitivity immunoassays. One of the promising labels are upconversion nanoparticles, which enable autofluorescence background-free measurement. This, in theory, makes it possible to measure even a single label molecule in the sample. However, In practice, the non-specific binding of labels is limiting the sensitivity. Immunoassays are also sensitive to various interferences arising from the sample matrix. These interferences can cause false positive and false negative results, which may lead to the wrong course of treatment.

The purpose of this study was to identify an interfering factor in a plasma sample in a two-step heterogeneous immunoassay using polyacrylic acid coated upconverting nanoparticles. The interfering component was enriched by fractionating the lithium-heparin plasma using ammonium sulphate precipitation, gel filtration chromatography and anion exchange chromatography. The fractions containing the interfering factor were analysed by troponin I-immunoassay. The final identification was done with gel electrophoresis and mass spectrometry.

The interfering factor was identified as complement component 1q (C1q), which is a pattern recognition molecule of C1 complex. C1 is part of the classical pathway and binds to antibodies bound to the surface of pathogens and other structures on pathogens, thereby activating complement cascade. The interference of C1q was mostly eliminated by adding heparin to the analyte buffer or by increasing the ionic strength of the assay buffer. C1q is a highly cationic protein and may interact with the anionic polyacrylic acid coating of upconverting nanoparticles through electrostatic interactions. The identification of C1q as an interfering factor enables the development of more specific countermeasures in the future.