CA-125 glykovarianttimäärityksen muuntaminen magneettipartikkelipohjaiseksi kemiluminesenssimääritykseksi

Abstract

Munasarjasyöpä on maailmanlaajuisesti naisten seitsemänneksi yleisin syöpä. Vuosittain todetaan yli 200 000 uutta tapausta ja taudin viiden vuoden eloonjäämisaste on noin 45 %. Munasarjasyöpään liittyy usein veren kasvanut CA-125-pitoisuus. Lisääntynyt CA-125-pitoisuus liittyy myös muihin sairauksiin kuten endometrioosiin, mikä vaikeuttaa kyseisen analyytin käyttöä diagnostiikassa. Munasarjasyövässä CA125-proteiinin glykosylaatiossa tapahtuu kuitenkin usein muutoksia ja näitä syöpään liittyviä glykovariantteja voidaan hyödyntää biomarkkerina munasarjasyövän diagnostiikassa. Työn tarkoituksena oli muuntaa olemassa oleva aikaerotteista fluoresenssia hyödyntävä glykovariantin tunnistava immunomääritys magneettipartikkelipohjaiseksi kemiluminesenssimääritykseksi. Kemiluminesenssi on yleisempi määritystekniikka kuin aikaerotteinen fluoresenssi, joten muunnoksella määritystä voitaisiin hyödyntää useammassa laboratoriossa. Kehitettävässä määrityksessä käytettiin magneettipartikkeleita, jotka oli pinnoitettu glykovariantin tunnistavalla vasta-aineella. Tällöin partikkelit kiinnittyivät CA-125:n glykosyloituun osaan. Määrityksessä käytettiin lisäksi HRP-entsyymillä leimattua CA-125:n tunnistavaa vasta-ainetta. Signaalin tuottamiseen käytettiin kemiluminoivaa ja väriä muodostavaa substraattia. Tällöin määritys tunnisti vain glykovariantin eikä normaalia CA125-proteiinia. Työssä vertailtiin muun muassa eri puskurien ja magneettipartikkelien vaikutusta määritykseen. Kehitettyä määritystä varten suunniteltiin ja 3D-tulostettiin levypesurin kanssa yhteensopiva magneettiteline, joka kiinnittyi 96-kuoppalevyihin. Määritys toimi kemiluminoivalla ja väriä muodostavalla substraatilla, mutta kemiluminesenssimääritys oli herkempi. Työssä havaittiin, että määrityksen suorituskykyyn vaikuttaa puskurien koostumus ja magneettipartikkelien ominaisuudet. Erityisesti magneettipartikkeleilla havaittiin olevan suuri merkitys määrityksen suorituskyvylle. Määritystä testattiin seerumi- ja potilaisnäytteillä. Näistä saatiin lupaavia tuloksia, mutta määritys vaatii edelleen optimointia, jotta se saadaan toimimaan luotettavasti potilasnäytteillä. Määritys siis toimii konseptitasolla, mikä on lupaavaa määrityksen jatkokehittämisen kannalta.

Globally ovarian cancer is the seventh most common cancer amongst women with over 200 000 new cases annually and a 45 % five-year survival rate. An increase in CA-125 blood concentration is often associated with ovarian cancer, but it is often associated with other diseases, such as endometriosis as well. However, in ovarian cancer there are often changes in CA-125 glycosylation and these glycovariants can be used as biomarkers in ovarian cancer diagnostics. The aim of this work was to convert an immunoassay using time resolved fluorescence into a magnetic particle-based chemiluminescent glycovariant assay. This way the immunoassay could be used in more laboratories, since chemiluminescent assays are more commonly used than time resolved fluoresce assays. Magnetic particles coated with glycovariant recognizing antibodies and HRP-labelled CA-125 recognizing antibodies were used in the developed assay. This way the magnetic particles would attach to the glycosylated part of CA-125 and thus only the specific CA-125 glycovariant was measured instead of all CA-125 in general. Chemiluminescent and colour developing substrates were used for generating the signal. The effects of using different magnetic particles and buffers were assessed. Also, a 96-wellplate magnetic separator compatible with a plate washer was designed and 3D-printed. The assay worked with both chemiluminescent and colour developing substrates. However, the chemiluminescent assay was more sensitive. Both the buffers and magnetic particles affected the performance of the assay. The magnetic particles had an especially big effect on assay performance. The assay was tested with both patient and spiked serum samples with promising results. However, the assay needs more optimization to be more reliable with patient samples. The assay worked as a proof of principle which is promising for further development of the assay.