Näytteenkäsittelymenetelmien arviointi automatisoidun molekyylidiagnostisen vieritestausjärjestelmän kehittämistä varten

Abstract

Infektiosairauksien nopea ja oikea diagnoosi on ensisijaisen tärkeää potilaan oikean hoidon kannalta. Vieritestaus (engl. point-of-care, POC) on yleistermi diagnostisille testeille, joilla testitulos saadaan nopeasti ja minimaalisella manuaalisella näytteenkäsittelyllä. Polymeraasiketjureaktio (engl. polymerase chain reaction, PCR) on luotettava menetelmä patogeenien havaitsemiseen, mutta näyte on esikäsiteltävä ensin. Tämä tehdään usein manuaalisesti, mikä ei ole toivottua POC-testeissä. Tämän työn tavoitteena oli löytää jatkotestejä varten lupaavia näytteenkäsittelymenetelmiä, jotka voi automatisoida ja integroida mahdollisimman yksinkertaisesti ja kustannustehokkaasti diagnostiseen POC-PCR-testijärjestelmään, jossa kaikki vaiheet näytteen esikäsittelystä tulosten tulkintaan tapahtuvat laitteen sisällä automaattisesti. PCR-näytteen esikäsittelyyn kuuluu patogeenien hajotus ja tarvittaessa nukleiinihappojen eristys. Hajotustesteissä keskityttiin helmihajotukseen vaikeasti hajotettaville patogeeneille, sekä kemialliseen hajotukseen helpommin hajotettaville patogeeneille. Helmihajotuksessa käytettiin sisäistä magneettia, jota pyöritettiin ulkoisen sähkömagneetin avulla. Tämän osoitettiin olevan toimiva hajotusmenetelmä vaikeasti hajotettaville patogeeneille. Kemiallisen hajotuksen todettiin olevan toimiva hajotusmenetelmä helposti hajotettaville patogeeneille. Näiden menetelmien optimointia jatketaan tämän työn jälkeen. Nukleiinihappojen eristykseen testattiin geelisuodatuspylvästä, silikapylvästä sekä magneettihelmiä. Geelipylväseristys oli näistä yksinkertaisin menetelmä, mutta menetelmällä ei voida konsentroida nukleiinihappoja, ja se toimi myös heikommin vaikeampien näytematriisien kanssa. Silikapylväseristys toimi tehokkaasti ja sillä voidaan konsentroida nukleiinihappoja. Kumpikin pylväs on kuitenkin hankala integroida tulevaan laitteeseen. Vaikka magneettihelmieristys ei ollut tehokkain eristysmenetelmä tässä työssä, sitä testattiin vain vähän, joten erilaisia magneettihelmiä testataan lisää tämän työn jälkeen.

The right and timely diagnosis of infectious diseases is extremely important for the accurate treatment of patients. Point-of-care (POC) testing is a general name for diagnostic tests, whereby the test answer is acquired quickly using minimal manual sample pretreatment. Polymerase chain reaction (PCR) is a reliable method for detecting pathogens, but the sample needs to be pretreated first. The pretreatment is usually done manually, which is poorly suited for point-of-care settings. The goal of this thesis was to find promising pretreatment methods for further testing. The methods should be possible to automate and integrate as simply and cost-effectively as possible into a diagnostic POC-PCR-instrument, where all steps, from sample pretreatment to analyzing the results, are done automatically inside the instrument. The pretreatment of PCR-samples consists of lysing the pathogen, and isolating the nucleic acids when required. In the lysis tests, the focus was on bead beating for pathogens that are difficult to lyse, and chemical lysis for pathogens that are easier to lyse. An internal magnet was made to rotate with the help of an external electromagnet in the bead beating method. This was shown to be an effective lysis method for pathogens that are difficult to lyse. Chemical lysis was shown to be an effective lysis method for pathogens that are easier to lyse. Optimization of both methods will be carried out after this thesis work. Gel filtration columns, silica spin columns and magnetic beads were tested for isolation of nucleic acids. Isolation with the gel filtration column was the simplest of the tested methods, but the nucleic acids cannot be concentrated with this method, and it worked poorly with more complex samples. Silica spin columns worked effectively, and they can be used to concentrate nucleic acids. However, either column would be complicated to integrate into the prospective instrument. Even though the magnetic beads were not the most effective isolation method tested in this work, their testing was very limited, so they will be tested more extensively after this thesis work.